中藥制劑蘭州方對免疫介導的再生障礙性貧血模型小鼠骨髓增殖的影響

黃邦榮，張永萍，倪 紅，李治梅

（1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2.武威腫瘤醫院，甘肅 武威 733000）

再生障礙性貧血（簡稱再障）屬中醫學“血虛”“血證”“虛勞”“虛損”及“血枯”等范疇，中醫認為腎主骨，骨藏髓，髓血同源，可見腎與骨髓造血有密切關系。中醫還認為“血者水谷之精也，生化于脾”“中焦受氣取汁，變化而赤是為血”，可見脾與造血也有一定關系。因此，辨證論治應以腎、脾為核心，尤其以腎為主。全國著名中西醫結合專家裴正學教授認為：健脾補腎是治療再障的根本大法，在此理論基礎上，根據多年臨床經驗，研制出具有補腎生髓、健脾益氣、養血和胃功效的蘭州方，對治療再障、調整機體免疫功能具有良好療效。為進一步研究中醫健脾補腎理論治療再障的作用機理，進行中藥制劑蘭州方對再障模型小鼠骨髓增殖的實驗研究，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康BALB/C小鼠90只，雌雄各半，體重（20±2）g，8～10周齡；DBA/2小鼠10只，雌雄各半，8周齡[1]。由甘肅省醫學科學研究院實驗動物中心提供，動物合格證號：醫動字第14-009號。

1.1.2 藥品 蘭州方（由生地、山萸肉、山藥、丹皮、北沙參、人參須、潞黨參、太子參、桂枝、浮小麥、大棗、麥冬、五味子、炙甘草、白芍、墓頭回等組成，由甘肅省蘭州市薈萃堂制成顆粒沖劑，每包含生藥量36.25 g），貞芪扶正顆粒（由佛慈制藥有限公司提供，國藥準字262020416）。

1.1.3 儀器 直線加速器（德國，西門子Primus）、光學顯微鏡（Olympus，Bx60-F5）、超凈工作臺（蘇凈集團，蘇州安泰空氣技術有限責任公司 VS-1300L型）、脫水機（德國，LEICATP1020）、切片機（德國，LEICARM2135）、病理組織漂烘處理儀（常州中威電子儀器廠，PHY-Ⅲ型）、包埋機（常州中威電子儀器廠，BMJ-Ⅲ型）、染色儀（常州中威電子儀器廠，CM1900HE）。

1.1.4 胸腺、淋巴結細胞懸液制備 取DBA/2小鼠斷頸處死，用75%酒精浸泡5分鐘，常規消毒后，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結，加少量生理鹽水，輕輕剪碎、碾碎后，用200目尼龍網過濾，通過4號針頭制作成單細胞懸液，臺盼藍鑒定細胞活性，活性細胞達95%以上。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照姚軍等再障造模，并根據趙忻等[2]關于免疫介導小鼠再障造模的方法進行改進，除正常對照組的15只BALB/C小鼠外，將其余75只BALB/C小鼠（剩余組）經直線加速器6 Mvγ射線照射全身，照射高度100 cm，時間1分鐘，劑量3.0 GY。照射4小時內，經尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結細胞懸液0.2 ml，細胞數1×106/只[3]。造模一周后，經尾靜脈采血，血分析結果表明：剩余組的白細胞、血小板、血紅蛋白與正常對照組比較，均明顯下降（P＜0.01或P＜0.05），見表1。骨髓涂片：造模一周后，每組隨機取5只小鼠，脫頸處死后取出左側股骨，用4號針頭取1 ml RPMI-1640液沖出骨髓滴于載玻片上推片，進行HE染色，在光學顯微鏡下進行骨髓組織形態學觀察[4]。結果表明，剩余組小鼠骨髓涂片顯示骨髓增生低下，粒系平均＜15%、紅系＜7%、巨核細胞0～7個/HP；正常對照組骨髓增生活躍，粒系平均＞40%、紅系平均＞14%、巨核細胞45～72個/HP，兩組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。以上結果證實本實驗所復制的免疫介導的再障小鼠模型是成功的[5]，可以按原方案進行后期實驗。

表1 直線加速器γ射線對再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影響（±s）

表1 直線加速器γ射線對再障小鼠外周血HGB、RBC、WBC、PLT的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

PLT（×109·L-1）1 588.4±240.00 655.3±125.96**組別正常對照組（n=15）剩余組（n=75）HGB（g·L-1）134±16.00 112±9.39*RBC（×1012·L-1）8.91±1.20 8.08±0.58 WBC（×109·L-1）9.12±3.36 4.20±0.96**

1.2.2 動物分組 將BALB/C小鼠90只隨機分組，其中正常對照組15只，蘭州方大、中、小劑量組各15只，模型組15只，貞芪扶正顆粒對照組15只。

1.2.3 給藥方法 模型組給予等量生理鹽水灌胃，蘭州方（顆粒）、貞芪扶正顆粒使用前分別用蒸餾水充分溶解，根據文獻中人/小鼠用藥等效劑量換算法，中藥的中劑量組相當于成人臨床用量的20倍[6]，故蘭州方大、中、小劑量組分別給予0.02 g/g·d、0.01 g/g·d和0.005 g/g·d藥液1 ml（相當于成人用量的40倍、20倍、10倍）；給予貞芪扶正顆粒每只0.01 g/g·d（相當于成人臨床用量的20倍）1 ml。各組均以普通飼料喂養，連續灌胃40天[7]。

1.2.4 小鼠骨髓有核細胞計數 骨髓有核細胞（BMC）提取：參照唐佩弦等[8]的方法，灌胃40天后，先用頸椎脫臼法處死小鼠，然后用鼠齒鑷夾住左側股骨（右側待用），剪去骨骺，用20號針頭刺穿骨末端，接著用注射器吸取RPMI-1640培養液2 ml向骨髓腔內快速推入，沖洗出骨髓細胞，收集在滅菌離心管內，最后用注射器反復推拉骨髓細胞懸液幾次，使骨髓細胞充分分散，制成懸液，以備光學顯微鏡下進行有核細胞計數。

將血球計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上，將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置3分鐘，鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下列公式計算：細胞數/ml=四大格細胞總數/4×10 000。

1.2.5 骨髓組織形態學觀察 取小鼠右側股骨中段，經甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片、HE-Giemsa染色等處理后備用。將切片放在光學顯微鏡的高倍鏡下（10×40）觀察，按文獻[4]方法，用5×5規格的網形測微器以計點法測定骨髓造血組織容量百分率，即時隨機選擇10個視野，觀察與記錄每個視野內10個點所擊中的目標，如果交接點擊中造血組織或脂肪組織或血竇，即記錄為1點；如擊中造血/脂肪組織的邊界，即記錄為1/2點，共觀察100點，按下列公式計算出造血組織、脂肪組織和血竇的容量百分率。造血組織容量百分率（%）=造血組織擊中數/（造血組織擊中數+脂肪組織擊中數+血竇擊中數）×100%。脂肪組織容量百分率（%）=脂肪組織擊中數/（造血組織擊中數+脂肪組織擊中數+血竇擊中數）×100%。

1.2.6 統計學方法 應用統計學軟件SPSS 10.0進行數據統計，所有實驗數據均以±s）表示。兩組計量資料采用Student's ttest檢驗，多組間計量資料采用單因素方差分析（One-way anovo），P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 股骨BMC計數（見表2）

表2 股骨BMC計數（±s）

表2 股骨BMC計數（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

分組正常對照組模型組蘭州方大劑量組蘭州方中劑量組蘭州方小劑量組貞芪扶正顆粒對照組有核細胞計數（×106/L）12.22±0.66 2.72±0.52*4.14±0.99**#6.34±0.14*##4.39±0.61**#4.32±0.32**##

由表2可見，模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對照組小鼠BMC計數較正常對照組小鼠明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對照組BMC計數較模型組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組BMC的計數與貞芪扶正顆粒對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 骨髓組織形態學觀察（見表3）

表3 骨髓組織形態學觀察（±s）

表3 骨髓組織形態學觀察（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與蘭州方中劑量組比較，△P＜0.05

分組正常對照組模型組蘭州方大劑量組蘭州方中劑量組蘭州方小劑量組貞芪扶正顆粒對照組造血組織容量百分率（%）92.22±0.66 10.72±2.52*26.57±2.24*#△36.38±2.34*#29.10±1.06*#△27.22±1.46**#△脂肪組織容量百分率（%）1.72±0.23 21.08±2.21*26.19±2.61**##△22.34±1.14**#24.14±0.99**##△28.32±0.35*#△

由表3可見，模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對照組造血組織容量百分率較正常對照組明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）；模型組，蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對照組脂肪組織容量百分率較正常對照組明顯增多（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、中、小劑量組，貞芪扶正顆粒對照組造血組織容量百分率較模型組顯著升高（P＜0.05），而脂肪組織容量百分率較模型組亦顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；蘭州方大、小劑量組造血組織容量百分率和脂肪組織容量百分率與貞芪扶正顆粒對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）；蘭州方中劑量組造血組織容量百分率高于蘭州方大、小劑量組和貞芪扶正顆粒對照組（P＜0.05）；蘭州方中劑量組脂肪組織容量百分率低于蘭州方大、小劑量組和貞芪扶正顆粒對照組（P＜0.05）。

3 討論

（1）骨髓造血是造血祖/干細胞通過有絲分裂分化增殖的動態過程，各級祖細胞經過不斷增殖分化，形成各種原始幼稚細胞，最后發育為成熟血細胞而釋放入周圍血。骨髓中的有核細胞由上述各級細胞組成，其數量變化在一定程度上代表了骨髓造血細胞增殖的程度。骨髓造血組織主要由網狀結締組織和造血細胞組成。網狀細胞和網狀纖維構成造血組織的網架，網孔中充滿不同發育階段的各種血細胞以及少量造血干細胞、巨噬細胞、脂肪細胞和間充質細胞等，造血組織含量的提高是骨髓造血細胞增殖量化的反映。

（2）本次結果表明，蘭州方中健脾補腎、益氣活血的中藥的確可以促進骨髓造血細胞增生，提高造血組織容量百分率，使用藥后蘭州方大、中、小劑量組造血組織容量百分率和脂肪組織容量百分率趨于1∶1的正常姿態，從而提高外周血象相關指標。大量臨床與實驗研究報道也證明[9-10]，健脾補腎活血的方藥能提高免疫介導再障小鼠骨髓CFU-GM、CFU-S、BFU-E、CFU-D、CFU-E產率，改善骨髓環境，從而調節和促進造血細胞的增殖分化，使造血組織容量百分率增加。除此之外，蘭州方能改善骨髓微環境，有利于骨髓基質細胞及其細胞外基質生長，增強基質細胞黏附造血細胞的能力，以此調節和促進造血細胞的增殖分化，使造血組織容量增加、外周血細胞回升。

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