細胞外囊泡在男性勃起功能障礙治療領域的應用進展

吳 寒 綜述 林浩成 姜 輝 審校

1. 北京大學第三醫院泌尿外科（北京 100191）;2.北京大學第三醫院生殖醫學中心; 3.北京大學第三醫院男科

勃起功能障礙（ED）是老年男性常見的性功能障礙疾病。其發病與年齡、生活方式及心血管疾病等有關。目前存在多種治療ED的方式，包括口服5型磷酸二酯酶抑制劑（PDE5Is）、經尿道給藥、低強度體外沖擊波、海綿體注射治療、真空負壓吸引及假體植入等，近年來干細胞治療概念在醫學領域逐漸成為研究的熱點，尤其在損傷修復領域，干細胞治療方興未艾，然而關于其療效發揮的具體作用機制仍存在爭議。干細胞本身具有多向分化潛能，同時還可能通過旁分泌機制發揮作用。近年來干細胞治療的旁分泌作用正越來越受到學界關注，已有大量研究證實其在干細胞治療過程中發揮的重要作用。目前認為干細胞旁分泌可能通過細胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）方式實現，本文將回顧EVs研究相關進展，并探討其應用于ED治療的可能性。

一、ED的治療

（一）現有的ED治療手段

過去的幾十年間，由于對勃起和ED機制了解的不斷深入，先后出現多種ED治療手段[1]。雖然目前口服PDE5Is已成為一線治療方式，但是其仍然存在一定局限性，如對同時服用硝酸鹽類藥物的患者存在誘發低血壓的風險；部分患者對藥物本身的副作用難以耐受；此外，高昂的藥品售價也在一定程度上限制了其應用[2]。現存的其他治療手段，包括經尿道給藥、海綿體內注射、真空吸引輔助勃起、海綿體假體植入等，均存在特定適應證和風險[3]。因此近年來學界對于探究包括基因治療和干細胞治療在內的新的、可治愈ED的治療方式的熱情與日俱增[4,5]。

（二）ED的干細胞治療

近年來，隨著ED逐漸被大眾認知并成為世界性的健康問題，ED的干細胞治療吸引了越來越多的注意。目前已證實干細胞對腫瘤、心血管系統疾病、神經系統疾病、免疫系統疾病等具有良好的治療效果[6-9]。

陰莖勃起主要依賴于海綿竇的充血，后者內襯單層內皮細胞（ECs），并被多層環狀和縱行的海綿體平滑肌（CSMCs）包繞。生理狀態下陰莖勃起的實現主要依賴一氧化氮能神經參與的一氧化氮/環一磷酸鳥苷（NO/cGMP）通路實現。多種病理因素通過損害上述3種勃起相關結構造成ED，常見的諸如前列腺癌根治術后的海綿體神經損傷、糖尿病造成的微血管病變和內皮損傷等[10]。干細胞是一類具有多向分化潛能的細胞，能夠向包括內皮細胞、平滑肌細胞、Schwann細胞和神經元細胞在內的多種細胞類型分化[11]，因此具備針對器質性ED各種損傷進行靶向治療的潛在價值。

已有許多臨床前研究證實多種干細胞能夠有效改善ED患者的勃起功能[12]，然而干細胞移植的安全性問題，尤其是移植后腫瘤形成風險也一直為學界所關注。首先目前認為多種腫瘤的形成起源于干細胞，因此移植后良性腫物或者侵襲性惡性畸胎瘤形成風險不可忽視。盡管目前已有相當數量的臨床前研究對干細胞移植后風險進行了評估，然而由于動物模型往往很難準確預測移植細胞在人類體內的最終結局；其次在某些臨床應用中，往往需要多次大量（通常以數十億記）使用移植細胞，在這樣的數量級面前，很難保證干細胞制品中不包含未分化細胞；最后，同傳統的藥物治療不同，普通藥物在人體內存在半衰期且通常清除較快，但干細胞治療設計之初就需要穩定數量的細胞在人體內長期發揮作用，而目前無論在動物還是在人體內，對注射后的移植細胞進行長期監控仍然缺乏有效手段，這樣就更增加了移植干細胞的不確定性[13]。鑒于此，一類由細胞產生的、由多種生物活性成分構成、能夠傳遞細胞間信號并具有細胞間成分交換功能的物質——細胞外囊泡（EVs）進入人們的視野。

二、干細胞細胞外囊泡（SC-EVs）

（一）EVs的發現

對細胞外囊泡最初的認知起始于上世紀80年代，Trams等的研究發現正常細胞及腫瘤細胞體外培養過程中產生的成分具有5’-核苷酸酶活性，并把這些成分命名為“微泡”（micro-vesicles）[14]。Johnstone等則將體外培養網織紅細胞成熟過程中發現的一類具有網織紅細胞膜結構和功能特征的小泡命名為外泌體（exosome）[15]。目前認為真核及原核細胞均能產生EVs[2,16-20]，EVs常充當細胞間信號傳遞和排出代謝廢物的途徑，同時細胞間亦通過EVs彼此交換成分，這一細胞間信息傳遞方式貫穿細胞存活全程，與生命活動各方面息息相關[21]。

（二）EVs的成分

EVs是一類包含蛋白、核酸和脂質等多種成分的具有多種功能的物質。人們對EVs的認知有賴于顯微鏡技術的進步。細胞產生的囊泡成分構成復雜，其構成主要由來源細胞種類及其所處的生理狀態決定。一般來說EVs膜富含糖鞘脂、膽固醇及磷脂酰絲氨酸[22]。EVs攜帶的蛋白種類同來源細胞類似，但存在一定區別。某些蛋白在EVs中的出現頻率很高，如HSP70、Alix、某些4次跨膜蛋白（如CD9，CD63，CD81等）以及重要組織相容性抗原II（MHCII）等。EVs攜帶的核酸成分多樣，包括DNA、核糖體RNA、mRNA和非編碼RNA，隨著學界對基因編輯的持續關注，目前基于EVs核酸成分的研究已成為本領域內的熱點[23]。

（三）EVs的分類

E V s依據外形可大致分為三類：（1）直徑20～150nm的exosome；（2）直徑稍大（50nm～1μm）的微泡（microvesicles），亦稱脫落囊泡（shedding vesicles）[24]；（3）直徑更大（50nm～5μm）的凋亡小體（apoptotic bodies）[25]。三者統稱EVs[19]。上述分類方法中，三類囊泡成分間存在重疊，因此隨著對EVs了解的不斷深入，開始有學者提出以EVs的來源區分其具體類型，如exosomes特指來源于胞內的一類EVs[26]，而microvesicles則指來源于細胞（特別是損傷細胞和轉化細胞）胞膜脫落結構[27]。

三、EVs的應用

（一）疾病診斷的新方法

現認為EVs的成分構成具有細胞特異性，同時也受來源細胞狀態的影響，個體在健康與不同疾病狀態下產生不同成分的EVs進入循環系統及體液中，因此能夠作為評價機體健康或疾病狀態的指標，在疾病早期診斷領域具有重要意義[28]。EVs作為疾病診斷工具的天然優勢有3點，首先是來源廣泛性，目前認為EVs的產生廣泛分布于全身各處的組織細胞，這是其反映全身多臟器系統生理病理狀態的基礎[29]；其次是分泌的連續性，由于EVs的產生是一個連續不斷的過程，這樣就使得EVs具備全天候反映機體所處的健康或疾病狀態的能力[30]；最后是可檢測途徑的多樣性，EVs存在于包括血液、尿液和腦脊液等多種體液成分，這種基于體液中EVs的疾病診斷方法被稱為體液活檢，能夠代替傳統活檢方式，避免了額外的手術取樣步驟、減少了不必要的損傷[31,32]。現已證實多種腫瘤細胞產生的EVs富含miRNAs，可以作為腫瘤早期診斷的特異marker[33]。除了腫瘤診斷外，EVs在非腫瘤疾病的診斷中也有重要作用，目前已得到證實的包括肝臟相關疾病、腎臟疾病、呼吸系統疾病、心血管疾病、神經系統疾病、代謝綜合征等均可通過EVs攜帶的疾病相關因子進行早期檢測[29,34-38]。

（二）潛在的疾病治療作用

過去數年間，隨著EVs在多種疾病中的病理生理作用被逐步發現，其在疾病治療中的可能作用備受關注，現有資料表明EVs本身攜帶的多種活性分子能夠調節靶細胞的基因表達和細胞功能。因此，EVs介導的自分泌、旁分泌、內分泌作用具備作為治療手段的潛力[39]。已有報道包括間充質干細胞（MSCs）在內的多種干細胞治療的效果——包括組織保護、內皮生成及損傷修復等——能夠通過提取并使用它們產生的EVs成分實現類似的治療作用[40,41]，近期相關研究也證實了EVs在基因治療、損傷修復、抗感染、癌癥治療等領域均有積極作用[39,42]。

以MSCs來源的EVs為例，目前已被證實能夠促進包括缺氧和高血壓損傷在內的多種心血管疾病損傷恢復[43,44]，其在腦損傷中的神經保護作用也得到確認[45]；在小鼠乳腺癌模型中，小鼠MSCs來源的EVs攜帶的miR-16等效應分子能夠通過降低VEGF水平降低腫瘤增殖效率[46]；少突膠質細胞來源的EVs能夠促進中樞神經系統髓鞘再生[47]。除上述直接作用外，EVs還能夠通過調節免疫和炎癥反應水平發揮生物效應，如選取高表達IL-4、IL10和TGF-β的樹突狀細胞作為來源，其產生的具有免疫抑制作用的EVs能夠在多種炎癥狀態中發揮對病變組織的保護作用[48]。

在ED干細胞治療領域，相當數量的動物實驗和少量人體試驗證實局部注射MSCs對包括糖尿病性ED和前列腺癌根治術后神經損傷性ED具有肯定效果[49-52]。近期Albersen等的研究比對了脂肪干細胞（ADSCs）及等量細胞勻漿對神經損傷小鼠的ED治療效果，兩者在改善陰莖勃起功能方面的作用并無統計學差異，表明ADSCs細胞勻漿成分可能具有相應的治療作用[53]，在這些勻漿中，EVs可能扮演重要的角色，進一步提示SC-EVs具備替代SC發揮疾病治療作用的潛能。

（三）EVs在ED治療領域的應用前景

1. 理想的靶向治療載體：除了包含細胞自然產生并包裝的成分，EVs同樣可以作為多種藥物的理想載體，并用于構建具有治療效果的效應分子-EVs復合物。EVs的多重特性決定了其潛在的靶向藥物載體潛能：脂質包膜結構增強了其在循環中的穩定性，某些蛋白成分也通過抑制補體和吞噬作用降低了EVs的清除率[54,55]，這樣就使得EVs適合作為某些低生物利用率藥物的載體[56]。另外，EVs能夠包裝多種物質，這樣就使得EVs能夠依據搭載物質的不同發揮多種作用[57]。此外已證實局部應用EVs能夠顯著增加靶細胞部位的EVs濃度，這一作用可能與EVs靶向識別細胞的能力有關，這就使得靶向治療存在可能[58]。EVs識別靶細胞的機制仍未完全闡明，目前認為EVs對靶細胞的定位可能通過EVs天然攜帶的表面分子與靶細胞的受體間特異識別實現。由于EVs攜帶的表面分子與其來源細胞具有同源性，因此當EVs來源細胞同靶細胞之間存在特異性識別關系時，EVs就可能通過特異識別富集到靶細胞上，從而實現靶向定位的效果[59]。

2. 解決海綿體內干細胞（stem cell, SC）注射后高清除率的合理途徑：目前最常見的ED細胞治療方式為海綿體內注射，但由于海綿體本身血供非常豐富，導致局部注射的細胞在極短時間內被清除并隨血流分布到全身各部[60]，治療效率低下。EVs局部注射后能夠高效作用于靶點部位這一特點解決了以往ED細胞治療中的薄弱一環，對EVs-靶細胞特異性結合機制的進一步闡明為構建高效的EVs靶向治療體系鞏固了理論基礎。

（四）EVs來源細胞的選擇

產生囊泡是細胞的共性，因此能夠產生EVs的細胞種類繁多，如何選擇恰當的來源不僅關系到對EVs作用機制的探索，更關乎其治療效果的最優化。一般來說，永生的細胞系產生EVs的效率較普通原代培養細胞高，且細胞的永生化特點使前者更有利于生產大量EVs。然而如前所述，此類永生細胞系產生的EVs存在致癌風險等不確定性。而原代培養細胞來源的EVs其特性更為明確，是相對理想的生物治療載體。同時，使用自體來源細胞收集的EVs能夠顯著降低免疫排斥作用。基于以上事實，EVs是理想的生物治療載體，自體原代培養細胞的EVs收集及利用是有效且合理的選擇。

對于ED細胞治療的理想細胞來源，學界一直在進行探索。2004年Bochinski等第一次證明了胚胎干細胞對神經損傷性ED的治療作用，研究證實將胚胎神經干細胞注入海綿體神經損傷模型大鼠體內3個月后，相比非治療組，大鼠勃起功能得到恢復，且一氧化氮合酶陽性神經纖維數量顯著上升，提示干細胞治療有效促進了損傷神經的恢復[61]。此后包括胚胎干細胞（ESCs）、內皮祖細胞（EPSCs）、MSCs、骨骼肌來源干細胞（SKMSCs）、脂肪干細胞（ADSCs）、睪丸基質細胞（HTSCs）和人尿干細胞（USCs）[4,62-67]在內的多種干細胞均被證明對治療神經損傷性ED有積極的治療作用。其中ADSCs由于相對容易獲取，不涉及胚胎及人體重要器官的損害，因此一直以來都是干細胞治療ED的研究熱點，目前已有許多文獻證實了其對神經損傷性ED的積極治療效果[4]。

MSCs能夠分化成脂肪、軟骨細胞、成骨細胞和包括星形膠質細胞，少突膠質細胞、小膠質細胞、神經元、神經膠質細胞在內的多種神經樣細胞，是外周神經損傷修復的理想干細胞類型。ADSCs是MSCs的一種，因其提取自成體脂肪組織，因此也被稱為脂肪來源間充質干細胞（ADMSCs），現已明確與傳統的骨髓來源相比，脂肪組織內包含的MSCs密度更大，獲取相對容易且對組織損傷更小，因此一直是干細胞治療領域的研究熱點[68]。近年來已有大量研究證實ADSCs在不同神經退變性疾病動物模型具有積極作用[69-71]，且發揮作用的機制以旁分泌效應為主[72-74]。目前認為此類旁分泌效應的發揮主要依賴于ADSCs-EVs實現[75]。由于目前有充分證據表明EVs在神經保護和再生過程中起重要作用[45,47,76,77]，越來越多的學者認為EVs能夠實現以往干細胞治療中的神經修復作用，即EVs能夠作為神經退變性疾病的非細胞治療手段[40, 45, 47, 77]。

四、ED治療領域EVs的應用前瞻

現已證實SC-EVs具備修復包括內皮、平滑肌及神經等多種組織損傷類型的能力，因此具備治療器質性ED的潛能[41,78,79]。僅就現有資料來看，EVs已明確的功能包括傳遞遺傳信息、作為載體搭載藥物及蛋白、靶向定位特定細胞類型并在生物體內充當穩定的藥物治療載體等。以此為基礎，目前SC-EVs在心腦血管疾病防治[43-45,47]、感染性疾病的疫苗研發[80,81]、腫瘤治療領域[82,83]的研究已取得一定進展，其在多種疾病中的治療效果亦得到證實。有學者認為EVs領域的未來進展可能集中在兩個方向，即：（1）利用并通過生物技術手段增強EVs搭載特定蛋白及RNA的能力、改善EVs對靶細胞的定位及后者對EVs的攝取能力以提升EVs的治療潛能；（2）構建具有EVs相似特性的脂質體或納米顆粒，開發新一代替代天然EVs的靶向治療制劑。筆者認為雖然EVs在多領域研究中的進展令人振奮，但其在ED治療領域的研究尚未見報道。因此目前對EVs能在多大程度上改善ED癥狀、通過何種機制或特定成分發揮ED治療作用以及不同SC來源的EVs在治療不同類型ED中的具體用量等問題仍待進一步研究。可以預見的是，對EVs的深入研究將進一步闡明其在細胞間信號傳導和物質交換的具體機制，從而推動EVs研究從具有前景的現象觀察向具備實際效應的成果產出進行轉化。

致謝：本文由國家自然科學基金青年科學基金項目（項目批準號：81601272）；北京市自然科學基金項目（資助編號：7174362）課題基金項目資助

勃起功能障礙; 細胞外囊泡

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