干擾長單一序列區83基因對人巨細胞病毒感染后人腦血管平滑肌促血管生成素及血管內皮生長因子表達的影響

劉磊，王佳偉，2

腦血管病嚴重威脅著人類健康和生命，約68%的缺血性腦血管病患者伴有動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）[1]。一項AS危險因子調查提示人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染是免疫功能正常人群發生AS的獨立危險因子[2]。而HCMV脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）主要見于AS斑塊內皮及血管平滑肌細胞核內[3]。許多急性心腦血管事件源于易損斑塊破裂[4]。已知HCMV感染后，可使血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）釋放大量血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[5]，后者可促進血管新生及滲漏，最終導致斑塊破裂。本研究通過HCMV感染人腦VSMC，隨后干擾其感染后再激活的標志——長單一序列區（unique long region 83，UL83）基因，探索該基因對促血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）、促血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）以及VEGF-A表達的影響及其與血管新生可能存在的聯系。

1 材料與方法

1.1 材料 病毒和細胞株HCMV AD169株（軍事醫學科學院）；人腦VSMC（ScienCell）；擴增病毒所需人胚肺成纖維細胞（中國醫學科學院）。

主要試劑：人腦VSMC培養基，多聚賴氨酸（ScienCell）；DMEM培養基（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）；Lipofectamin 2000；Opti-MEM，TRIZOL Reagent，SuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce）；胰蛋白酶（Merck）；Taq DNA Polymerase，dNTP（Takara）；抗體：抗HCMV pp65、抗人Ang-1、Ang-2、VEGF-A（Abcam）；抗人β-actin（Santa Crz）。

1.2 人胚肺成纖維細胞培養 細胞置于含有10%胎牛血清DMEM培養液中，在37℃、5%CO2條件下培養。細胞貼壁生長至鋪滿90%后，以0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，取對數生長期細胞進行實驗。

表1 RT-PCR引物設計與合成（上海生物工程公司）

表2 HCMV UL83基因siRNA設計與合成（上海吉瑪制藥技術有限公司）

1.3 病毒擴增與毒力滴定 將10～15代人胚肺成纖維細胞接種于75 cm2培養瓶中，待細胞生長至80%匯合狀態時接種HCMV AD169病毒液，感染滴度為5 0半數細胞感染量（median tissue cultureinfective dose，TCID50）＝10-5/0.1 ml，當完全出現細胞病變（cytopathogenic effect，CPE）時收集細胞，凍存于-70℃備用。將系列稀釋好的病毒液接種于含人胚肺成纖維細胞的96孔板中，每個稀釋度滴定6個復孔，每孔100 μl。于37℃、5%CO2培養箱培養7～10 d。每天觀察并記錄出現CPE（細胞病變）的孔數，直到CPE不再發展為止，進行毒力測定。

1.4 流式細胞儀檢測小干擾核糖核酸轉染人腦VSMC 6 h后轉染效率 將人腦VSMC以2×105/孔密度接種于6孔板內培養40 h。轉染前2 h，將陳舊培養基吸出，每孔加入1.5 ml不含抗生素及血清的人腦VSMC培養基；將10 μl 20 μM FAM熒光標記小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）與250 μl Opti-MEM在EP管中混合；將Lipofectamine 2000輕柔搖勻，取5 μl與稀釋的siRNAs混合均勻，室溫靜置20 min，形成siRNA——轉染試劑混合物。將siRNA——轉染試劑混合物加入6孔板中，使siRNAs終濃度為100 nM，輕輕搖動6孔板使其混合均勻；將6孔板置入37℃、5%CO2培養箱中，6 h后吸出上清。胰酶消化后制備血細胞懸濁液，使用流式細胞儀檢測siRNA轉染效率。

1.5 HCMV感染人腦VSMC后干擾UL83基因表達實驗分組 此部分實驗共分6組進行：①空白組（未接毒未轉染），②接毒組（只接毒未轉染），③接毒無效干擾組，④接毒干擾S1靶點組，⑤接毒干擾S2靶點組，⑥接毒干擾S3靶點組。最終篩選出干擾效率最高的靶點。

1.5.1 HCMV AD169感染 將人腦VSMC以2×105/孔密度接種于6孔板內培養24 h；使用HCMV AD169（MOI=10）病毒液吸附人腦VSMC，每孔加入病毒液約1 ml，37℃、5%CO2培養箱孵育1 h后吸走殘余病毒液；加入含4%胎牛血清培養基置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養16 h。

1.5.2 siRNA轉染HCMV AD169感染后人腦VSMC 將無效干擾siRNA以及針對UL83基因S1、S2、S3靶點siRNA分別轉染至感染后人腦VSMC。再加入含4%胎牛血清培養基繼續培養48 h或72 h。

1.5.3 RT-PCR檢測各組UL83基因mRNA表達情況 Trizol法提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，得到的cDNA用于逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）反應，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）為內參，檢測各組U L 8 3基因信使R N A（messenger RNA，mRNA）的表達。

1.5.4 Western Blot檢測各組UL83基因編碼pp65蛋白表達 以1500rpm離心5 min收集人腦VSMC后用PBS洗滌2次。向各組加入細胞裂解液重懸細胞，于冰上放置30 min后，以12 000 rpm離心20 min。將離心獲得上清中的蛋白進行BCA定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性處理。各組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉印至PVDF膜上進行Western Blot檢測。以β-actin作為內參蛋白。對曝光膠片進行掃描，用ImageJ 1.38x圖像分析系統對每例樣品的不同蛋白條帶分別進行面積和平均灰度的測量，以二者乘積表示某樣品中某蛋白的絕對含量；將其與內參（該樣品中actin蛋白的絕對含量）之比作為最終蛋白含量測量數據，進行統計學分析。

1.6 HCMV感染人腦VSMC后各時間點Ang-1，Ang-2以及VEGF-A表達情況 參照前述方法，分別采用RT-PCR及Western Blot對HCMV感染人腦VSMC后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h以及72 h Ang-1、Ang-2、VEGF-A的mRNA及蛋白進行檢測。

1.7 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1、Ang-2以及VEGF-A表達情況此部分實驗共分4組進行：①空白組（未接毒未轉染），②接毒高效干擾組，③接毒無效干擾組，④接毒組（只接毒未轉染）。

RT-PCR檢測各組干擾48 h后Ang-1，Ang-2及VEGF-A的mRNA表達情況。

Western Blot檢測各組干擾72 h后Ang-1，Ang-2及VEGF-A蛋白表達情況。

1.8 統計學方法 使用中位數描述非正態分布資料，對于正態分布資料使用

表示其平均水平。每項實驗重復3遍。SSPS 14.0軟件應用秩和檢驗進行總體和（或）組間比較分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA轉染人腦VSMC 6 h后轉染效率流式細胞儀顯示細胞懸濁液當中95.59%人腦VSMC內有FAM熒光標記siRNA，表明轉染效率理想，該脂質體介導化學合成siRNA轉染體系可靠。

2.2 siRNA干擾48 h后各組UL83基因mRNA表達效率 HCMV感染人腦VSMC后18 h轉染siRNA，轉染后48 h收集細胞。結果顯示分別轉染siRNA的S1、S2、S3組中UL83mRNA表達與接毒組相比均被抑制，分別為后者的62.5%、27.6%和21.3%；空白組由于未接毒，故不表達UL83mRNA；接毒無效干擾組UL83mRNA表達量為接毒組93.7%（圖1A）。因此，S2及S3干擾UL83基因轉錄mRNA的效率最高，分別為72.4%和78.7%。

2.3 siRNA干擾72 h后各組UL83基因編碼pp65蛋白表達效率 HCMV感染人腦VSMC后18 h轉染siRNA，轉染后72 h收集細胞。發現分別轉染siRNA的S1、S2、S3組中UL83編碼pp65蛋白表達與接毒組相比均被抑制，分別為后者的68.2%、25.4%和18.7%；空白組由于沒有接毒，因此不表達pp65蛋白；接毒無效干擾組pp65蛋白表達量為接毒組96.3%（圖1B）。因此S2及S3干擾UL83基因編碼pp65蛋白效率最高，分別為74.6%和81.3%。

圖1 HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后各組UL83 mRNA和UL83基因編碼pp65蛋白的表達情況

2.4 HCMV感染人腦VSMC 0～72h后Ang-1、Ang-2以及VEGF-A mRNA表達變化Ang-1 mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為0.768±0.007，0.712±0.009，0.542±0.003，0.436±0.006，0.302±0.004和0.287±0.008（組間P＜0.01）。

Ang-2 mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為0.213±0.002，0.286±0.004，0.364±0.002，0.638±0.004，0.827±0.015，0.852±0.017（組間P＜0.01）。

VEGF-A mRNA在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為0.201±0.003、0.292±0.007、0.317±0.009、0.527±0.008、0.754±0.016、0.801±0.014（組間P＜0.01）（圖2A）。

圖2 HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后不同時間點Ang-1、Ang-2及VEGF-A mRNA表達變化

2.5 HCMV感染人腦VSMC 0～72 h后Ang-1、Ang-2及VEGF-A蛋白表達變化 Ang-1蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為1.215±0.006、1.172±0.004、0.984±0.007、0.785±0.005、0.638±0.007、0.614±0.003（組間P＜0.01）。

Ang-2蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為0.593±0.003、0.645±0.006、0.732±0.007、0.917±0.006、1.035±0.009、1.270±0.012（組間P＜0.01）。

VEGF-A蛋白在感染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相對表達量分別為0.483±0.005、0.627±0.006、0.675±0.008、0.752±0.010、1.187±0.013、1.213±0.018（組間P＜0.01）（圖2B）。

2.6 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1，Ang-2以及VEGF-A mRNA表達情況 Ang-1 mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.875±0.004、0.832±0.003、0.289±0.002、0.276±0.005。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

Ang-2 mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.312±0.007、0.304±0.006、0.873±0.008、0.921±0.012。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

VEGF-A mRNA在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.272±0.003、0.284±0.012、0.753±0.009、0.791±0.008。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01（圖3A）。

2.7 HCMV感染人腦VSMC后UL83基因高效干擾組Ang-1，Ang-2及VEGF-A蛋白表達情況

Ang-1蛋白在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.838±0.009、0.775±0.006、0.192±0.004、0.018±0.003。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

Ang-2蛋白在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.593±0.008、0.784±0.003、1.274±0.004、1.342±0.003。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01。

VEGF-A在空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組及接毒組的相對表達量分別為0.542±0.005、0.779±0.003、1.373±0.006、1.392±0.002。接毒高效干擾組分別與接毒無效干擾組及接毒組相比，組間P值均＜0.01（圖3B）。

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒β亞科，是免疫抑制、器官移植患者的嚴重致病、致死因素[6]。目前，HCMV慢性感染及其潛伏感染再激活與動脈粥樣硬化之間的關系也日益得到學術界的重視。HCMVUL83基因編碼65kDa的磷酸化蛋白pp65（phosphoprotein 65）在病毒潛伏－再激活感染狀態中起著關鍵作用。國際公認將pp65抗原檢測定為明確HCMV激活感染的標準方法。本課題組前期發現HCMVUL83基因通過某種途徑激活了血管緊張素ⅡAT1受體基因表達，由于已知后者通過結合血管緊張素Ⅱ經NF-B信號途徑影響易損斑塊穩定性，因此提示HCMV感染后，UL83基因與易損斑塊的穩定性可能存在密切關系[7]。

易損斑塊與穩定斑塊相比，存在明顯的血管新生現象。斑塊內的新生血管大多是不成熟的，由于缺乏細胞間的緊密連接，因此容易發生滲漏，使得炎癥細胞和紅細胞進入斑塊甚至血管腔[8-9]。血管新生需要多種因子參與，其中VEGF-A是公認最有效、快速的血管滲透機制誘導因子。Ang是第一個被確定來源于人腫瘤組織并具有促血管生成作用的細胞因子家族[10]，其中Ang-1、Ang-2與血管生成關系最為密切。質譜分析發現HCMV的分泌蛋白質組包括1000多種由該病毒誘導產生的促進血管和組織修復的新生蛋白，其中包括VEGF及Ang[11]。

圖3 空白組、接毒高效干擾組、接毒無效干擾組和接毒組HCMV AD169（MOI＝10）感染人腦VSMC后Ang-1、Ang-2及VEGF-A的mRNA和蛋白的表達情況

目前已知Ang-1和Ang-2及其受體Tie-2對新生血管的成熟至關重要。Ang-1和Ang-2主要由包括人腦VSMC、血管周細胞在內的壁細胞以及內皮細胞產生。其中Ang-1是Tie-2生理狀態下的主要配體，參與調控新生血管的管徑和數目，并通過增加內皮細胞和壁細胞的聯系來達到穩定新生血管，抑制內皮細胞凋亡，減少其滲漏[12-13]。Ang-2作為Ang-1拮抗劑，雖也可結合Tie-2，但不引起后者磷酸化，從而使內皮細胞容易對VEGF等促生長因子發生反應，誘導腫瘤血管生長。此外，Ang-2的作用相比Ang-1更具有多樣性：在沒有VEGF存在的情況下，Ang-2拮抗Ang-1，使血管退化；而當VEGF存在時，Ang-2則促進新生血管出芽[14]。目前已經在易損斑塊內發現Ang-2/Ang-1比例升高[15]。血管新生依賴于內皮細胞遷移、增殖以及血管周細胞對新生血管芽的包裹覆蓋，這一過程需要VEGF和血小板源性生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）的相互協調[16]。VEGF不僅干擾內皮細胞之間的緊密連接而且通過抑制PDGF介導血管周細胞覆蓋新生血管芽來干擾新生血管的成熟[17-18]。本實驗表明，人腦VSMC被HCMV感染后的極早期（6 h后），其本身便創造了促進血管新生并阻礙其成熟的微環境，即Ang1表達下調，而Ang-2及VEGF-A表達上調，并且這一趨勢隨時間而延續。但是，本實驗沒有觀察到Ang-2較VEGF提前表達這一在腫瘤組織和動物腦缺血后血管新生模型當中遇到的現象[19]。

本實驗中接毒有效干擾組Ang-1、Ang-2、VEGF-A mRNA及蛋白表達量受到明顯抑制，表明UL83基因至少在HCMV感染18 h后參與了上述基因表達的變化，反向證明UL83基因參與創造促進血管新生并阻礙其成熟的微環境。

未來為了進一步明確UL83基因作用，還需正向單獨轉染其進入人腦VSMC，觀察并印證Ang-1、Ang-2、VEGF-A的后續表達情況。此外，在正向及反向實驗均證實UL83基因對Ang-1、Ang-2、VEGF-A表達的作用基礎上，應當繼續探討UL83基因是通過具體哪一種信號途徑參與到上述病理生理過程的。

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