去乙?；?在人頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達及其臨床意義

薛曉帆， 齊 丹， 李新輝， 劉 冉， 張海東， 曲愛娟， 周立春

腦卒中作為死亡率及致殘率最高的疾病嚴重影響患者的預后及生活質量[1，2]，動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)，尤其是頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis,CAS)是引發缺血性腦卒中發病的重要病理基礎，CAS造成的缺血性腦卒中占全部腦卒中的19%～35%[3]。隨著CAS的進展，不穩定斑塊的破裂形成血栓，栓塞脫落后引發腦卒中是缺血性腦卒中的重要發病機制，“氧化應激學說”作為AS斑塊穩定性下降的可能發病機制之一被人們廣泛關注，但具體信號通路及分子機制目前仍不清楚。沉默信息調節因子2相關酶類3(silent mating type information regulation2 homolog-3,SIRT3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide,NAD)的Ⅲ類去乙?；竅4]。SIRT3主要位于線粒體，廣泛分布于腎臟、腦、心臟及肝臟等富含線粒體的組織器官中，可對組蛋白和非組蛋白去乙酰化在調控細胞代謝、細胞周期、細胞凋亡及細胞壽命方面起著重要的作用[5，6]。SIRT3通過去乙?；嚓P蛋白調節生物活性，在抵抗氧化應激反應、改善血管內皮細胞功能等多種心血管疾病中，都起到了保護性作用，但在粥樣硬化斑塊組織中的表達及與之相關臨床意義之間的研究甚少[7,8]。因此，了解SIRT3在AS斑塊形成及穩定性中的作用，及可能調控的信號通路具有學術價值，對早期發現、早期干預從而減少缺血性心腦血管疾病的發生，有著至關重要的意義。本文采用免疫組化、免疫印跡法及免疫熒光共定位法檢測6例人頸動脈組織中SIRT3的表達情況，并探討其與AS斑塊形成及發展之間可能存在的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2017年4月～2017年9月在首都醫科大學附屬北京朝陽醫院尸檢中心行尸體解剖檢查且個人資料完整的6例患者，其中男5例，女1例，年齡分布39～85歲，取其雙側完整頸動脈(頸總動脈+頸動脈竇部+頸內動脈+頸外動脈)長度約8～10 cm，所取左側完整組織分段進行石蠟切片完成H&E染色、Masson’s trichrome染色，冰凍切片完成油紅O染色、免疫組化染色及免疫熒光共定位染色；所取右側組織放入液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存用于免疫印跡法檢測SIRT3表達含量。所取標本及相關流程已得到首都醫科大學附屬北京朝陽醫院倫理委員會批準。

1.2 H&E染色、Masson’s trichrome染色及油紅O染色 所取6例左側頸動脈組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，一部分常規石蠟包埋，制作頸動脈石蠟切片(4 μm)10張，常規蘇木精-伊紅染色(H&E染色)，中性樹膠封片2張；另一部分用于冰凍切片(7 μm)，Masson’s trichrome染色:(1)冰凍切片復溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內10%重絡酸鉀+10%三氯乙酸染色40 min后蒸餾水洗2～3遍;(4)用0.09 g麗春紅+0.01 g酸品紅+100 μl冰醋酸+9.9 ml蒸餾水配制的紅色染料染色5 min;(5)1%磷鉬酸浸泡5 min后，1%冰醋酸沖洗1～2遍，鏡下觀察上色情況;(6)用0.24 g苯胺藍+200 μl冰醋酸+9.8 ml蒸餾水配制的藍色染料染色30～40 s，后用1%磷鉬酸及1%冰醋酸各沖洗一遍，鏡下觀察上色情況;(7)無水乙醇中浸泡5 s后中性樹膠封片保存,染色2張，油紅O染色:(1)冰凍切片復溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)60%異丙醇滴染同步化10 min;(4)甩掉并擦干凈異丙醇溶液，以0.25油紅粉末+50 ml異丙醇配制的0.5%油紅染料用蒸餾水稀釋成濃度為60%的油紅染料染色30 min;(5)異丙醇沖洗后用蒸餾水洗3遍，鏡下觀察染色情況;(6)甘油明膠封片,2張，鏡下觀察6例人頸部血管組織病理學特點，按照動脈粥樣硬化斑塊病理學分期標準進行分期[9](Ⅰ期脂紋脂斑期;Ⅱ期纖維斑塊期;Ⅲ期粥樣斑塊期;Ⅳ期復合病變期)。

1.3 免疫組化 采用免疫組化Max Vision二步法:第1天：(1)冰凍切片復溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內以內源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織20 min后蒸餾水洗3遍;(4)羊血清封閉非特異性抗原濕盒內30 min;(5)甩掉浮液后加入以1∶100配制SIRT3抗體(兔多克隆Anti-SIRT3抗體-C-terminal，abcam公司，貨號ab137689)4 ℃冰箱過夜12 h。第2天：(1)室溫復溫30 min，蒸餾水洗3遍;(2)山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(CST公司，貨號7074)室溫孵育30 min后蒸餾水洗3遍;(3)配制DAB顯色劑(上?；蚩萍加邢薰?，貨號GK600505/50次，GK600510/100次，GK600511/1000次)染色7～10 s，鏡下觀察組織顯淡黃色后置于蒸餾水中浸泡;(4)蘇木素染色10～15 s;(5)鹽酸分化液洗片2～3 s;(6)流水沖洗反藍5 min;(7)鏡下觀察染色情況后走免疫組化下行通路，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，已證實的SIRT3染色陽性的切片作為陽性對照組，同時選取正常血管組織作為正常對照組。SIRT3染色陽性表達位于胞質內，呈清晰棕黃色顆粒。每張切片隨機觀察5個高倍鏡視野，判斷標準以顯色細胞數面積占斑塊總面積的比值進行評估。

1.4 免疫熒光共定位 免疫熒光共定位染色法:第1天：(1)冰凍切片復溫30 min后蒸餾水洗3遍;(2)4%多聚甲醛固定10 min后蒸餾水洗2～3遍;(3)濕盒內以內源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織20 min后蒸餾水洗3遍;(4)羊血清封閉非特異性抗原濕盒內30 min;(5)分別以小鼠單克隆CD31(PharMingen公司，貨號553300)、α-SMA(abcam公司，貨號ab7817)及MAC-2(SantaCruz公司，貨號sc-32790)3種抗體標記組織中內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞，分別加入SIRT3抗體及PBS，以1∶1∶100分別配制3種一抗混合液，滴染各組片子4 ℃冰箱過夜12 h；第2天：(1)室溫復溫30 min，蒸餾水洗3遍;(2)以1∶1∶100比例配制山羊抗小鼠IgG/TRITC(中杉金橋公司，貨號ZF-0313)紅光二抗及山羊抗小鼠IgG/FITC(中杉金橋公司，貨號ZF-0312)綠光二抗混合液，加至片子后濕盒保存1 h后蒸餾水洗5遍;(3)DAPI封片，4 ℃保存;(4)熒光顯微鏡暗室拍照。觀察各類細胞內SIRT3染色差異，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，Ⅰ期及Ⅳ期人頸動脈粥樣硬化斑塊組織染色陽性的切片作為陽性對照組，同時選取正常血管組織作為正常對照組。

1.5 免疫印跡法 Western blot檢測，取保存于-80 ℃冰箱的組織樣本：(1)用高效RIPA裂解液(Solarbio公司，貨號R0010)提取總蛋白;(2)采用BCA法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液;(3)100攝氏度煮沸5～10 min變性;(4)12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳，每孔上樣總蛋白約30 μg左右，后進行轉膜;(5)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;(6)TBST洗膜后加入SIRT3及β-ACTIN抗體，用5%BSA稀釋，稀釋比例均為1∶1000，4攝氏度搖床過夜;(7)TBST洗膜后二抗室溫孵育1 h，運用ECL試劑盒發光、顯影、定影、沖洗晾干、拍照并成像分析，運用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值，將SIRT3/β-ACTIN的比值作為蛋白表達的相對量。

1.6 統計學分析 采用Prism 6 軟件進行統計學分析，對Western blot檢測的蛋白相對表達量運用t檢驗，免疫組化測定結果進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 H&E染色、Masson’s trichrome染色、油紅O染色進行人頸動脈粥樣硬化斑塊組織的分期及臨床病理特征的分析結果 6例患者病理切片均按照動脈粥樣硬化病理分期分為2例正常血管，2例Ⅰ期脂紋脂斑期，2例Ⅳ期復合病變期。

2.2 免疫印跡法結果提示SIRT3在人頸動脈Ⅳ期粥樣硬化斑塊血管組織中顯著表達 目的條帶SIRT3分子量為29 kD，β-ACTIN分子量為43 kD。SIRT3在Ⅳ期斑塊組織中的蛋白表達量明顯高于Ⅰ期斑塊及正常血管組織(見圖1)。

2.3 免疫組化檢測SIRT3在人Ⅳ期頸動脈粥樣硬化斑塊中顯著表達 SIRT3表達陽性在免疫組化染色中呈棕黃色顆粒，主要位于細胞質染色。結果顯示2例正常血管組織中未見陽性細胞表達，2例I期斑塊組織中偶見陽性細胞，2例Ⅳ期斑塊組織中SIRT3陽性細胞表達率為40%(24/60)(見圖2)。

2.4 SIRT3在人Ⅳ期頸動脈粥樣硬化斑塊中的內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞內均表達 SIRT3由TRITC熒光二抗標記為紅色，主要位于細胞質染色。內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞分別由CD31、α-SMA及MAC-2一抗標記，由FITC熒光二抗標記為綠色，細胞核由DAPI標記為藍色，Merge后共定位染色為橙黃色。結果顯示2例正常血管組織中未見SIRT3表達，2例Ⅰ期斑塊組織中偶見少量SIRT3表達，2例Ⅳ期斑塊組織中內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞內均可見大量SIRT3表達。

圖1 正常頸動脈組織、Ⅰ期斑塊組織及Ⅳ期斑塊組織中SIRT3表達

3 討 論

動脈粥樣硬化(AS)是引發缺血性腦卒中發生的重要病理基礎，在AS的發生發展過程中，線粒體氧化應激損傷作為斑塊穩定性下降的可能機制被人們廣泛關注。多重危險因素(高脂血癥、高血壓、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、吸煙、肥胖等)引起血管內皮細胞損傷和功能失調，從而產生大量ROS，促進過氧化物酶產生，同時激活內皮細胞源性炎性因子如TNF-α及多種白細胞介素等表達[10，11]。ROS介導的氧化應激反應和炎性因子介導的炎性反應同時可誘導低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的氧化修飾，形成修飾的低密度脂蛋白(ox-LDL)，引起平滑肌細胞的增殖與凋亡。細胞因子和ox-LDL能激活NF-κB信號通路，被激活的NF-κB遷移至細胞核，誘導多種細胞間基質表達，其中包括內皮細胞粘附因子(VCAM)、金屬蛋白酶(MMPs)等，促使AS斑塊形成并降解細胞外基質，削弱纖維帽，使斑塊穩定性下降，引發血栓、斑塊破裂、斑塊內出血、動脈瘤等多種繼發性改變[12,13]。如何維持內皮細胞穩定及線粒體功能，避免功能失調作為AS斑塊形成的啟動靶點成為AS斑塊研究的主要方向。

目前研究證實Sirt3能對線粒體內多種乙酰化蛋白脫乙?；?，增加ROS清除酶活性和穩定線粒體功能，抑制線粒體內ROS的蓄積，改善可由ROS增多并激活NF-κB通路，減輕氧化應激誘發的細胞損傷過程[14]。Someya等研究證實[15]。線粒體內Srit3過表達，使乙?；腎DH2脫乙?；岣逳ADPH的水平，抑制ROS的產出，延遲老年性聽力喪失疾病的發生。仍有研究證實S3過表達后，使超氧化物歧化酶-2(SOD-2)兩個關鍵的賴氨酸殘基去乙?；瑥亩鴾p少ROS的產生，阻礙Bax蛋白移位到線粒體，減少氧化應激誘導的細胞凋亡[16]。Sundaresan等[17]研究發現，SIRT3對乙?；霓D錄因子Foxo3a脫乙?；螅蛊溥M入細胞核，并提高依賴Foxo3a的抗氧化基因轉錄產物錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)及過氧化氫酶(CAT)的mRNA表達水平，抑制細胞內ROS的蓄積，阻斷了ROS誘導激活的通路上游靶點Ras基因，并抑制下游信號通路MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt，減輕氧化應激反應。

本實驗結果初步證實了與正常人頸部血管組織相比，SIRT3在人CASIV期斑塊組織中是顯著表達的，這可能與AS斑塊形成及發展過程中線粒體氧化應激損傷相關。且在斑塊發展過程中，SIRT3的表達也存在差異，Ⅳ期斑塊組織中SIRT3表達量明顯高于Ⅰ期粥樣硬化組織，免疫印跡法檢測Ⅰ期斑塊未見SIRT3表達可能與表達量過少相關。且免疫熒光共定位染色結果提示SIRT3廣泛表達于Ⅳ期斑塊中的內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞內。既往研究證實，SIRT3可以通過去乙酰化線粒體相關蛋白，減輕ROS的累積，維持血管內皮細胞的穩定性[18]。且一般情況下低氧可以誘導SIRT3表達增加，SIRT3在內皮細胞抗氧化信號通路中活性增強，起到維持內皮細胞線粒體功能的作用[19]。由此推測，SIRT3可能參與了CAS斑塊形成過程，并起到了穩定斑塊的保護性作用，但具體的信號通路及作用機制目前尚不明確，仍需進一步大樣本重復試驗，本課題組將進一步應用動物及細胞實驗驗證上述結果，且確定SIRT3通過去乙?；畏N蛋白來發揮作用，來證實其在AS斑塊穩定性中的角色。

綜上所述，SIRT3可能與AS斑塊的發生、發展相關，其在Ⅳ期斑塊中的高表達可能在斑塊穩定性中起到了一定作用，但目前研究SIRT3與AS斑塊形成及穩定性之間的相關研究較少，如能確定SIRT3蛋白在斑塊穩定性中的保護性機制，可能成為潛在的檢測指標及基因治療的一個作用靶點，為缺血性心腦血管疾病的預防有著重要的臨床意義。

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圖2 正常頸動脈組織、Ⅰ期斑塊組織及Ⅳ期斑塊組織中SIRT3免疫組化染色結果