HLA-B*1502表達與AEDs致敏相關性的臨床研究

侯蘊祈， 石海琴， 楊紅姬

在中國癲癇發病人數近千萬，需要長期服用抗癲癇藥物，包括新舊抗癲癇藥物，臨床上廣泛應用于癲癇、神經痛、精神性疾病等方面，大部分為芳香族(aromatic antiepileptic drugs,AEDs)，該類藥物因具有類似的化學結構并均攜帶苯環，最常見的不良反應是引起皮疹，目前多觀點認為，AEDs在身體經酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復合物，誘發后來的過敏反應[1]。引發的過敏反應在不同人種、不同民族、地緣遠近地區中也有所不同。這說明過敏反應可能與基因相關，有研究顯示中國臺灣和香港地區癲癇患者應用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強的相關性[2]。在中國漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽性基因型[3]。目前該基因與所有的AEDs的相關性尚不確定，需要臨床研究提供進一步的證據[4]。如能明確HLA-B*1502陽性基因型是AEDs致敏的必要條件，對指導臨床用藥有很大意義，本研究通過對AEDs致敏性和HLA-B*1502關系進行分析，探尋HLA-B*1502是否可以作為潛在的靶點蛋白，以求為患者預后的判斷提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年1月1日-2017年6月31日我院門診與住院部及廣州醫科大學附屬二院神經科學研究所AEDs致敏性患者75例資料。均為AEDs誘導皮膚不良反應的患者，男性35例，女性40例，診斷為AEDs致敏性，平均年齡為(5.94±1.85)歲。病例隨訪中，最短的隨訪14個月，最長的58個月，中位隨訪時間為45個月，其中單藥致敏組36例，男性18例，女性18例，平均年齡為(5.71±1.96)歲；多藥致敏組39例，男性17例，女性22例，平均年齡為(5.99±1.85)歲；輕型藥疹組40例，男性20例，女性20例，平均年齡為(5.75±1.85)歲；抗癲癇藥物高敏綜合征組35例，男性15例，女性20例，平均年齡為(5.98±1.75)歲；同時納入健康對照組60例，男性31例，女性29例，平均年齡為(5.75±1.79)歲；組間年齡、性別無顯著差異。

1.2 方法 RNA提取及RT-PCR反應：采集入組患者和正常志愿者靜脈血，EDTA抗凝管收集后用德國QIAGEN公司DNA抽提試劑測定DNA純度和濃度，調至30 μg/ml在-40 ℃保存。順序特異性引物聚合酶鏈反應(sequence spcific primers，PCR-SSP):設計6對特異性引物(分別為S1、S2、S3、S4/s5、s6)及兩對內參引物(C1、C2)。25 μl PCR反應體系：DNA50 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq聚合酶0.05 U/μl,各引物終濃度為1 μmol/L,反應緩沖液終濃度為1×PCP緩沖液。PCR反應：擴增熱循環：96 ℃預變性60 s,96 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,2 ℃延伸45 s,4個循環，96 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸45 s,21個循環，96 ℃變性10 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,9個循環。 2.0%凝膠電泳檢測，凝膠成像系統熒光成像。

1.3 統計學方法 本研究統計學數據采用SPSS 18.0進行統計分析，精確概率法、卡方檢驗對計數資料進行分析，相關性檢驗通過Pearson相關分析，數據分析以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502表達 AEDs致敏性組HLA-B*1502表達陽性率顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。分析AEDs致敏性患者病例中HLA-B*1502表達，發現HLA-B*1502表達在患者年齡、性別等方面無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

2.2 AEDs致敏性組織中HLA-B*1502的表達與致敏藥物的數量相關性分析 多藥致敏組HLA-B*1502基因陽性表達高于單藥致敏組；抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽性表達高于輕型藥疹組，HLA-B*1502表達水平越高，致敏藥物越多(見表2、圖1)。

表1 患者的血液標本中HLA-B*1502表達情況

與健康對照組比較#P<0.05

表2 AEDs致敏性HLA-B*1502的表達與致敏藥物的數量、皮膚不良反應的臨床表現的嚴重程度情況

多藥致敏組與單藥致敏組比較#P<0.05；抗癲癇藥高敏綜合征組與輕型藥疹組比較*P<0.05

圖1 HLA-B*1502表達水平與致敏藥物數量相關性分析

3 討 論

癲癇是小兒與成人神經系統常見疾病之一。據統計全球平均每年每10萬人就有50例新發病例，總共約有5000萬癲癇患者，其中又以兒童及青少年居多，常常影響患兒的神經生理發育及生活質量[5]。目前口服抗癲癇藥物仍是臨床上治療的主要方法，包括新舊抗癲癇藥物，簡稱AED，臨床上廣泛應用于癲癇、神經痛、精神性疾病等方面，大部分為AEDs，該類藥物最常見的不良反應是引起皮疹，輕者為斑疹、丘疹或斑丘疹(MPE)，嚴重時甚至出現超敏綜合征(HSS)、史蒂文斯-約翰綜合征(SJS)或中毒性表皮松解壞死(TEN)等，表現為皮膚水泡樣皮疹，皮膚脫落，累及皮膚黏膜、內臟軀干及四肢，整體皮膚表面積分離，致死率高達40%[6～8]。臨床常用的芳香族抗癲癇藥物主要包括卡馬西平、奧卡西平、拉莫三嗪、苯妥英鈉、苯巴比妥等，可有新近研究也提示非芳香族抗癲癇藥也可誘導機體高敏反應。雖然由AEDs誘發的嚴重過敏反應發病率較低，但是因其嚴重威脅患者的生命和用藥安全，越來越受到相關領域專家學者的重視[9]。

目前認為藥疹的發生是一種免疫應答反應，目前多觀點認為，AEDs在身體經酶代謝后與蛋白多肽形成半抗原復合物，誘發后來的過敏反應。引發的過敏反應在不同人種、不同民族、地緣遠近地區中也有所不同[10]。這說明過敏反應可能與基因相關，而近年來的研究報道指向AEDs致敏反應與HLA等位基因具相關性，而且該基因在中國人群中比例較高。HLA是人類基因調控人體免疫應答特異性及影響個體疾病易感性差異的主要多態性系統，有研究表明，HLA-B*1502基因與CBZ引起的SJS、TEN密切相關，且mRNA表達水平顯著高于耐受組[11]。有研究顯示中國臺灣和香港地區癲癇患者應用CBZ引致的SJS、TEN和HLA-B*1502有較強的相關性[12]。在中國漢族人群中，8%～15%或更多的人可能是HLA-B*1502陽性基因型。目前該基因與所有的AEDs的相關性尚不確定，需要臨床研究提供進一步的證據[13]。目前大陸地區相關方面的臨床研究少見報道，且已有報道樣本尚少，佛山地區尚缺乏相關地區的基因篩查及流行病學調查[14]，本課題就是進一步研究我地區AEDs引起的過敏反應是否和HLA-B*1502基因相關，如能明確HLA-B*1502陽性基因型是AEDs致敏的必要條件，對指導臨床用藥有很大意義，可以在長期服藥前進行基因篩查，避免致敏的可能，減少病患的痛苦及減輕不必要的醫療支出。

在本研究中，我們通過對75例AEDs致敏性組織HLA-B*1502的陽性表達情況，分析致敏藥物的數量、皮膚不良反應不同與HLA-B*1502基因表達的差異性，結果顯示，在AEDs致敏組中陽性表達要遠高于陰性表達，差異具有統計學意義，與王蕊艷等[15]研究結論相似。結果表明HLA-B*1502表達陽性率增高與AEDs致敏性的發生可能有密切的關系。目前國內外研究顯示，常見的芳香族類AEDs包括多個種類，芳香族類AEDs的化學結構中均含有芳香環，氧化代謝產生含有芳香環的中間產物，在細胞色素P450酶的作用下，該中間產物在環氧化物羥化酶的作用下生成能溶于水的代謝產物，當肝臟環氧化物羥化酶缺乏或功能缺陷時，經腎臟排出體外，芳香類氧化物大量堆積，進而誘導細胞凋亡，結合形成大分子物質，同時激活特異性T淋巴細胞，誘導皮膚不良反應的發生，啟動機體免疫反應，因此芳香族類AEDs誘發皮膚不良反應的發生率較高[16]。全基因組關聯分析(genome-wide association study,GWAS) 被越來越多地應用于遺傳異質性的研究中，越來越多的研究發現，遺傳異質性與人類白細胞抗原(human leukocytes antigen,HLA)基因密切相關[17]。已有研究證實了，AEDs致敏導致的皮膚不良反應與HLA-B*1502基因型有關[18]。既往研究僅分析AEDs所致皮膚不良反應與HLA-B*1502等位基因的相關性。但并未對比輕型藥疹與重癥藥疹、多藥致敏與單藥致敏之間HLA-B*1502等位基因表達的差異。本研究分析了HLA-B*1502的表達與AEDs致敏性的關系，發現且多藥致敏組HLA-B*1502基因陽性表達高于單藥致敏組，抗癲癇藥物高敏綜合征組HLA-B*1502基因陽性表達高于輕型藥疹組，通過相關性分析發現，HLA-B*1502表達越高致敏藥物數量越多。

本研究未收集HLA-B*1502的表達與AEDs致敏性預后的影響，因此我們將在之后的研究中進一步擴大樣本量，詳細收集AEDs致敏性藥物干預對AEDs致敏性預后的影響，分析HLA-B*1502的表達在藥物治療效果的差異性和耐藥性中的作用。綜上所述，HLA-B*1502在AEDs致敏性的發生發展中扮演重要的角色，HLA-B*1502可能成為AEDs致敏性的治療的新靶點，對AEDs致敏性診斷及預后有重要的價值。

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