miR-132調控神經環路-突觸可塑性與改善卒中后癡呆的機制研究

張雪玲， 王黎明， 陳念東， 杜合賓， 張沈陽， 錢 來， 陳 靜， 王一峰

卒中后癡呆是腦卒中后最常見的心理行為障礙并發癥，在卒中患者中的發病率為25%～79%。卒中后癡呆主要表現為腦卒中后的情緒低落和興趣減退，延緩神經功能的恢復，增加死亡率，極大降低了卒中患者的生活質量[1]。雖然卒中是卒中后癡呆的直接原因，但其引起卒中后癡呆的具體機制尚未完全清楚，給治療帶來極大的困難。研究卒中后癡呆的發病機制，尋求早診斷、早預防、早治療的有效辦法，具有重要的社會和科學意義。有研究表明，額葉-皮質下神經環路損害與卒中后癡呆有關，但損害的機制尚不清楚，突觸可塑性直接影響神經環路的重塑，從而直接影響認知功能。近年來，miRNAs在轉錄后水平對突觸可塑性的調控越來越受到研究者的關注，有關miRNA調控卒中后癡呆相關的認知神經環路(額葉-皮質下神經環路)突觸可塑性研究尚未見報道，miR-132到底調控何種基因影響卒中后癡呆相關的額葉-皮質下神經環路突觸可塑性？通過本項研究，期望發現miRNA調控卒中后癡呆相關的額葉-皮質下神經環路突觸可塑性的關鍵基因，為臨床早期診斷尋找分子標志物(biomarkers)以及發現治療卒中后癡呆新靶點，為臨床轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗步驟 從生物學水平驗證miR-132參與卒中后癡呆調控的靶點以及其相關機制 應用水迷宮檢測兩組小鼠的認知能力，共48只大鼠入組：12只大鼠不作任何處理(對照組)，12只大鼠經大腦中動脈阻塞+慢性溫和刺激制作卒中后癡呆模型(卒中后癡呆組)，12只大鼠經大腦中動脈阻塞+腦室注射agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132組)，12只大鼠經大腦中動脈阻塞+腦室注射agomir-NC+慢性溫和刺激(agomir-NC組)。為確定Grin2A是否參與miR-132抗卒中后癡呆作用,實驗將含Grin2A基因的表達質粒經腦室注入卒中后癡呆大鼠腦內。24只大鼠被添加入組：12只大鼠經大腦中動脈阻塞+腦室注射AAV9-CMV-Grin2A質粒和agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132+Grin2A組);12只大鼠經大腦中動脈阻塞+腦室注射空質粒和agomir-132+慢性溫和刺激(agomir-132+vector組)。

1.2 實驗方法介紹

1.2.1 Morris水迷宮 從定位航行實驗和空間探索實驗評價各組小鼠的認知功能，檢測指標包括：逃避潛伏期時間、各象限游泳距離、原平臺象限游泳距離與總距離之比等。

1.2.2 腦室注射慢病毒質粒 腦室注射方法參考Nishida等的方法。卒中后癡呆模型的建立:所有大鼠在腦室注射慢病毒質粒48 h后，采用大腦中動脈阻塞法制作腦缺血再灌注模型。

1.2.3 大鼠行為檢測 曠野試驗：參考Wang等的方法制作敞箱，在安靜的情況下將大鼠放入箱內，觀察記錄大鼠穿越的方格數作為水平活動得分(以大鼠四爪均進入方格為準)，以大鼠直立次數為垂直活動得分(兩前肢離地一次為準)。每只大鼠測定3次，每次3 min。蔗糖水消耗試驗:禁水禁食20 h后，所有大鼠同時給予1瓶1%濃度的蔗糖水和1瓶清水，計算1 h內大鼠蔗糖水的消耗量(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+清水消耗量)×100%。

1.2.4 實時定量PCR監測miR-132表達 按Duan等的方法進行PCR測定卒中后癡呆大鼠腦內和外周血中的miR-132的表達，步驟如下：總RNA通過Trizol(美國Sigma-Aldrich公司)提取后，使用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)進行cDNA合成。2.5 μl合成的cDNA 1 μl特異性引物(廣州銳博生物科技有限公司)加入Trans Start T SYBR Green qPCR Supermix(北京全式金公司)后進行實時定量PCR測定miR-132水平，PCR儀(美國ABI公司)檢測PCR產物SyBR綠色熒光強度，以小RNA分子U6為內參定量產物濃度。

2 實驗結果

2.1 miR-132改善卒中后癡呆小鼠認知功能(水迷宮實驗) 實驗結果表明，miR-132減少卒中后癡呆大鼠的行為學有改善作用(見圖1)。

2.2 過表達Grin2A阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學的改善作用 研究結果發現， agomir-132組的大鼠垂直得分(80±0.31)，水平得分(78±0.28)，均高于模型組(P<0.05)，說明miR-132可改善卒中后癡呆相關的額葉-皮質下神經環路的突觸可塑性，從而改善PSD小鼠認知功能； agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分(75±0.26)，水平得分為(73±0.39)；而陰性對照(agomir-132+vector)大鼠垂直得分(78±0.18)，水平得分為(76±0.35)，因此，agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對照(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，說明Grin2A基因的表達可以抑制miR-132調控突觸可塑性。同時，agomir-132組糖水消耗百分比為(52±0.59)%；agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比為(26±0.58)%；其陰性對照組(agomir-132+vector)糖水消耗百分比為(48±0.32)%，因此，agomir-132組糖水消耗百分比高于模型組和陰性對照組(P<0.05)，說明miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學的改善作用；agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比明顯低于其陰性對照組(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，表明Grin2A參與了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用(見表1)。

2.3 結論 卒中后癡呆的發病率正受到醫學界越來越多的關注。相關研究證明腦卒中后癡呆的發生率與神經功能缺損程度具有相關性。神經退行性疾病是一組典型的遲發的、漸進性的紊亂，能夠導致認知和運動障礙。本文通過對大鼠的實驗證明，miR-132通過改善額葉-皮質環路突觸的可塑性改善卒中后大鼠的認知功能，Grin2A可以阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學的改善作用。

表1 過表達Grin2A阻斷miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學的改善作用

組間比較aP<0.05，bP<0.05，abP<0.05

圖1A：miR-132 減少卒中后癡呆大鼠逃避潛伏期；B：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限游泳距離；C：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠穿臺次數；D：miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限時間

3 討 論

卒中后癡呆(post-stroke dementia，PSD)是指卒中后發生的所有癡呆類型，包括血管性癡呆(vascular dementia，VaD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或其他變性性癡呆以及混合型癡呆。流行病學調查顯示，卒中可使癡呆風險增高至少2倍；由于研究人群和研究方法的不同，卒中發病后1 y內的癡呆發生率范圍為7.4%～41.3%不等[2]。長期隨訪研究顯示，PSD可對至少半數卒中存活者產生影響，可增高卒中病死率和殘疾率，嚴重影響存活時間。PSD的發病機制涉及炎癥反應、氧化應激、谷氨酸興奮毒性、Ca2+超載、免疫抑制、膽堿能系統功能障礙等多種病理生理學過程[3]。卒中導致關鍵部位病變，如海馬或腦白質病變、微出血等，造成皮質-皮質下環路結構和功能破壞，是PSD發生的主要解剖學機制。

在神經系統中，大量神經元通過突觸相互聯系形成神經回路。中樞神經系統的興奮性突觸主要以谷氨酸為遞質，突觸前神經元釋放谷氨酸，通過突觸后的谷氨酸受體(AMPA和NMDA兩種亞型)，將突觸前神經元的信號傳遞到突觸后神經元。谷氨酸與AMPA受體結合，使突觸后神經元去極化，從而產生脈沖發放,NMDA受體與谷氨酸結合，將突觸前電信號轉變成突觸后神經元內的Ca2+信號，啟動一系列生化級聯反應，導致突觸的可塑性變化[4]。在神經元樹突棘上，谷氨酸受體及其偶聯的信號轉導通路，通過各種支架蛋白形成突觸后致密區(PSD)，它含有幾百種蛋白質。這種復雜而精巧的棘突結構，是接收突觸前信號并進行生化加工的獨立單元。樹突棘能對接收的大量信號進行神經計算和整合，并依據刺激的方式做出反應，使突觸的結構和功能發生相應變化，即形成突觸的可塑性。

根據突觸功能可塑性變化的性質不同，它可分為長時程增強(long term potentiation,LTP)和長時程抑制(long term depression,LTD)[5]。它們均能選擇性地修飾行使功能的突觸，使突觸連接增強或減弱，因而能貯存大量信息，被認為是學習和記憶的神經基礎。突觸可塑性可分為與傳遞效率有關的功能可塑性和與信息貯存相關的樹突棘形態變化的結構可塑性。突觸不僅能通過對AMPA受體通道的修飾以及AMPA受體插入和遷出突觸來增強或抑制突觸的傳遞效率，而且能通過樹突棘的增大和萎縮以及棘的消失和新棘的形成使傳遞效率發生變化[6]。突觸可塑性因神經細胞種類、發育階段、激活方式不同而變化，其形成機制復雜而多樣。由于它可能是學習和記憶的神經基礎，長期以來一直都是分子和細胞神經生物學的熱門研究領域之一。

人源miR132定位于染色體17p13.3，富含于腦組織，尤其是在海馬區高表達。miR132在多種神經系統相關疾病或者模型動物中表達下調，包括阿爾茨海默病、胎兒無腦畸形、亨廷頓疾病、精神分類癥和雙相情感障礙、帕金森病，并且miR132還能影響一些突觸相關蛋白的表達，研究證實體外過表達miR132會引起谷氨酸受體NR2A、NR2B、G1uR1的表達上調。有報道顯示miR132的生物合成受到CRAB和REST的雙向調控，并且隨著LTP表達過程中也會平行性的升高。體外實驗表明miR132和BDNF以及Mecp2能夠形成反饋調節環路[7]。

miR132可以通過抑制一種GTP酶活性依賴蛋白p250GAP的表達而誘導皮質和海馬區樹突的外向性生長和改變樹突的形態，并且體內敲除miR132則會導致突觸的減少和抑制新生神經元的遷移。最新研究揭示在原代培養的神經元中敲除miR132導致FOX03a的表達升高而誘導大量的神經元凋亡。另外，選擇性在小鼠邊緣皮質過表達miR132會引起LTP和LTD的降低而導致短期記憶損傷。miR132：由于參與了眾多的神經生理和病理過程而被稱為“NeurimmiR”，以上的研究結果也說明miR132涉及到了突觸可塑性和學習記憶的過程，但是具體的分子機制現在還不清楚。探索miRl32調控神經環路-突觸可塑性對于一些神經退行性疾病的理解和治療非常有意義。

卒中后癡呆是腦血管病后最常見的心理行為障礙并發癥，其發病機制目前尚未明確。目前研究表明，micro RNA與神經發生和突觸形成有關，可能在精神疾病中扮演至關重要的作用[8，9]。各種干細胞中均存在特異性的miRNA，并且在干細胞的不同分化階段亦有特異性miRNA表達，它們是保持干細胞自我更新和多向分化特性的關鍵分子之一;在細胞的不同發育階段，miRNA的組成不同，決定了細胞的分化方向以及分化時相，是細胞定時、定向分化的開關[10]。miR-132基因在所有物種中有相同的結構，在大鼠、小鼠和人中2個基因均呈串聯排列，分別位于10、11和17號染色體上，稱為miR-132基因簇。根據miRNA編碼基因在基因組中的位置分為基因間miRNAs和基因內miRNAs。在人的基因組中，miR-132基因簇位于染色體17p13.3，含有3個外顯子基因(AK006051)的第1個內含子內，為基因內miRNA。miR-132 可調控多個蛋白。文獻報道[11 ]，miR-132抑制p250GAP的翻譯過程，調節Rac1或 RhoA來調控突觸棘的形態學發生發展。在新生的大鼠海馬中，miR132呈低表達，但是在出生后 7～21 d，其表達量增高，與突觸發生的活躍期相關。在海馬神經元中，抑制miR-132可以減弱突觸棘發生的活性以及突觸棘的大小，而過表達miR-132可以加強此作用。且miR-132/p250GAP可通過調節突觸特異性的kalirin7/Rac1/Pak信號途徑來調控Rac1的活性和突觸棘發生。另外還有研究表明，BDNF誘導的miR-132表達可以上調突觸上的谷氨酸受體，調控突觸的結構和功能[12 ]。

本研究發現，miR-132減少卒中后癡呆大鼠逃避潛伏期， miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限游泳距離， miR-132可提高卒中后癡呆大鼠穿臺次數，miR-132可提高卒中后癡呆大鼠目標象限時間。結果表明，miR-132對減少卒中后癡呆大鼠的行為學有改善作用；同時，本研究表明agomir-132組的大鼠垂直得分和水平得分均高于模型組(P<0.05)，說明miR-132 可改善卒中后癡呆相關的額葉-皮質下神經環路的突觸可塑性，從而改善卒中后大鼠的認知功能；agomir-132+Grin2A組的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對照(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，說明Grin2A基因的表達可以抑制miR-132調控突觸可塑性。agomir-132組糖水消耗百分比高于模型組和陰性對照組(P<0.05)，說明miR-132對卒中后癡呆大鼠行為學的改善作用，agomir132+Grin2A組糖水消耗百分比明顯低于其陰性對照組(agomir-132+vector)和agomir-132組(P<0.05)，表明Grin2A參與并抑制了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用，與國內外研究結果一致，說明miR-132通過調控神經環路-突觸可塑性從而改善卒中后癡呆大鼠的行為學特征，Grin2A參與并抑制了miR-132對卒中后癡呆大鼠的治療作用，該研究結果為臨床早期診斷和治療卒中后癡呆提供新的理念和策略。

[1]陳鑫玥,胡雪玲,孫麗華.MiR-132的生理功能及其在疾病中的作用[J].中國醫藥導報,2014,34(29):159-161.

[2]劉 芬,李 勇,趙 寧,等.MicroRNA-132增強乙酰膽堿對肺泡巨噬細胞炎癥反應的抑制作用[J].中華急診醫學雜志,2015,24(12):1402-1406.

[3]王新德,陳海波,蔡曉杰.老年人腦血管性癡呆的研究[J].中華老年醫學雜志,2012,11(3):138.

[4]朱正兵,趙 英.腦血管性癡呆的評定與診斷[J].國外醫學腦血管病分冊,2013,3(6):299.

[5]Wilczynska A,Bushell M.The complexity of mi RNA-mediated repression[J].Cell Death and Differentiation,2015,22(1):22-23.

[6]Guo J,Wang H,Wang Q,et al.Expression of p-CREB and activity-dependent miR-132 in temporal lobe epilepsy[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(5):1297-1306.

[7]Huang Y,Guo J,Wang Q,et al.MicroRNA-132 silencing decreases the spontaneous recurrent seizures[J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2014,7(7):1639-1649.

[8]Hancock ML,Preitner N，Aquin J,et al.MicroRNA-132 is enriched in developing axons,locally regulates Rasa1 mRNA,and promotes axon extension[J].The Journal of Neuroscience,2014,34(1):66-78.

[9]Cummings J.Dementia,principles of diagnosis and management[J].The Older Patient,2012,22(1):23.

[10]O'Brien MD.How does cerebrovascular disease cause dementia[J].Dementia,2013,24(5):133.

[11]Wayman GA.An activity-regulated microRNA controls dendritic plasticity bydown-regulating p250GAP[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(26):9093-9098.

[12]Hansen KF.Transgenic miR132 alters neuronal spine density and impairs novelobject recognition memory[J].PLoS One,2010,5(11):e15497.