淋病奈瑟菌耐藥外排泵研究進展

周 可 陳紹椿 尹躍平

淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)所致的泌尿生殖系統化膿性炎性疾病。目前，淋病仍是全球最常見性傳播疾病，僅在2012年全球新發病例78,000,000例[1]。中國每年報告約11.5萬例新發淋病病例，最新調查結果表明，2013-2016年期間，阿奇霉素耐藥和頭孢曲松耐藥的比例都有所增加，較日本略低，明顯高于美洲和歐洲等國家的報道[2]。抗生素是淋病治療的唯一有效手段，由于抗生素的廣泛使用，淋球菌對抗生素的耐藥明顯增加，給防治和控制本病帶來嚴重困難。在奈瑟菌屬，目前已有研究的4個外排泵系統分別為：MtrCDE、MacAB、NorM和FarAB。其中MtrCDE，MacAB，NorM和FarAB系統分別屬于耐藥節結化細胞分化家族(resistance/nodulation/cell division family，RND)、ATP結合盒超家族(ATP-binding cassette superfamily ABC)、多藥及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)和主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MF)。此外一些菌株還發現MtrF以及一種由mef編碼的泵蛋白。淋病奈瑟菌的MtrCDE可以排出不同的疏水性抗菌藥物，如青霉素、廣譜頭孢菌素、環丙沙星和四環素、膽鹽、陽離子抗菌肽；MacAB與淋球菌對青霉素G的敏感性增加有關；同時MtrCDE和FarAB也會參與排出內源性抗菌劑，包括陽離子抗菌肽和長鏈脂肪酸。對于這幾種泵的研究逐漸深入，對于有關淋球菌流行病學研究，淋球菌發病機制以及新藥開發均有一定作用。下面對幾種外排泵的結構、功能、調控及突變對淋球菌多重耐藥的影響分別進行介紹。

1 MtrCDE-MtrR

淋球菌主要侵犯黏膜表面，這些部位通常被含有脂溶性因子(hydrophobic agents, HAs)如:毒性脂酸、膽鹽等的黏液覆蓋。早在1978年，Sparling即在HAs抵抗的分子機制尚不清楚的情況下，發現mtr(multiple transferable resistance)系統，即多重可傳遞耐藥系統，它的存在可以幫助淋球菌抵抗糞便中脂類及膽鹽的毒性而生存于特定器官的黏膜表面。淋球菌對HAs耐受性是因為菌體細胞能把HAs其有效地排出細胞體外[3]。mtr作為一個以質子運動提供能量的能量依賴型外排泵，與其它一些細菌的外排系統類似，如綠膿桿菌的mexAB-oprM系統、大腸桿菌的acrAB 和 acrEF-TolC系統等[4]。完整的淋球菌mtr外排系統是一個多重可傳遞耐藥操縱子，包括mtrR調控基因及mtrCDE基因復合物,其中mtrC、mtrD、mtrE三者的開放閱框呈串聯排列形成一共轉錄體即mtrCDE[5]。下面分別介紹mtrCDE，mtrR的結構功能及調控系統。

1.1 mtrCDE-mtrR的編碼基因及結構功能 mtrC為膜融合蛋白類輔助蛋白，mtrD為外排蛋白，mtrE為外膜通道蛋白。mtrC使位于細胞膜的mtrD與外膜的mtrE相連接，依賴質子耦聯交換產生的質子驅動力將胞內及胞間隙的底物泵出細菌。mtrR為調控基因編碼阻遏蛋白，抑制mtrCDE的外排功能。

1.1.1 mtrC mtrC基因由1239 bp組成，編碼大小44kDa的膜蛋白，位于細胞周質間隙歸屬于MFPs家族，其編碼蛋白與大腸桿菌的McrA及EnvC蛋白、綠膿桿菌的MexA蛋白有同源性。編碼該蛋白的基因受位于上游250 bp處的mtrR表達調控，同時mtrC內若含有4 bp的缺失(349-GCGC-352)，將在mtrC基因鏈上產生一個新的終止密碼，而生成面目全非的mtrC蛋白，從而影響mtr外排泵系統的完整性[6,7]。

1.1.2 mtrD mtrD基因由3204 bp組成，是mtr系統中最大的，起始密碼子依次位于mtrC終止密碼子下游12 bp處，編碼大小33KDa膜蛋白，其包括14個螺旋結構和兩個環形結構，位于細胞質膜。該蛋白與大腸桿菌的AcrE蛋白和綠膿桿菌的MexB蛋白同源，同屬于RND家族成員，為能量依賴型蛋白運輸抗生素及細菌產物至菌體細胞外液。mtrD帶有一個56個氨基酸的信號肽可能對淋球菌細胞內HAs的濃度變化敏感，并將信號傳遞給mtrD[8,9]。

1.1.3 mtrE mtrE基因位于mtrD終止密碼TAA的52bp下游，由1404bp組成，編碼48.3KDa膜蛋白，屬外膜外排蛋白，與綠膿桿菌OprM蛋白和大腸桿菌TolC蛋白功能一致。其部分基因序列與綠膿桿菌的oprM基因有36.2%的同源性[10,11]。mtrE是一種由三個結構域組成的同質三聚體：一個嵌入在外膜中的β桶結構域，一個α桶結構域，將100多個結構域投射到細胞質周圍，以及一個位于α桶中間的赤道結構域。到目前為止，mtrE是唯一在結構上確定顯示開放構象的RND家族外膜通道蛋白[12]。有學者通過全原子分子動力學模擬分析發現，膜融合蛋白MtrC與膜外表面的結合能穩定通道的開放狀態，因此發現MtrCDE的外膜通道蛋白和膜融合蛋白之間的接觸區域可幫助外部藥物流出管道開放和封閉狀態之間的轉換，這個界面可能是一個潛在的干預位點[13]。

1.1.4 mtrR mtrR基因位于mtrC基因的上游，由633bp組成，是外排系統最小的基因，編碼蛋白分子量為23KDa，由210個氨基酸組成。MtrR蛋白作為QacR/TetR家族成員，尤其與四環素抑制子家族、LuXR轉錄活化子具有同源性。結合于mtrCDE基因啟動子區域對mtr系統的轉錄起負調控作用[14]。

1.2 mtr系統的調控 目前已知mtr系統對淋球菌多重耐藥在基因水平上有兩種調控機制，分別為mtrR依賴調節機制和非mtrR依賴調節機制。前者由于mtrRCDE基因復合物中mtrR基因有缺失或突變引起；后者是mtrR啟動區的13 bp插入一重復序列，這個序列是一個反轉控制序列，它位于mtrR和mtrC基因(-10～-35)之間，此序列中的一對堿基缺失，對mtrR和mtrC基因的表達有相反的作用，使mtrR基因表達減少，mtrC基因表達增加，從而使淋球菌對HAs的耐受性增加。由于mtrR基因編碼轉錄抑制蛋白，mtrR基因的突變導致外排泵抑制作用減弱或消失，使mtrR基因下游的mtrCDE基因轉錄開放，細胞膜中的mtrCDE蛋白增多。過多的mtrCDE蛋白使外排系統功能增強，故增加了對多種不利于淋球菌生長的物質的抵抗力[15]。此外，在mtrR啟動區13 bp重復序列2個堿基TT的插入，直接導致86位氨基酸Thr轉變成Ala以及105位氨基酸His轉變成Tyr，從而導致淋球菌對紅霉素及阿奇霉素敏感性降低或產生耐藥[16]。為了定義由mtrR調控的基因，采用微陣列技術對MtrR陽性和MtrR陰性淋球菌的中對數期發酵液中提取的總RNA進行分析，發現mtrR可以直接或間接地調節69個基因，其中被抑制基因(包含mtrCDE操縱子)有47個，被激活基因有22個。其中一種被抑制的基因是rpoH，它編碼了另一種應激反應sigma因子 (sigma 32)，這似乎是淋球菌在溫度升高條件下具備生存能力的必要條件。除了對mtrCDE的調節和對疏水性抗菌藥物的淋球菌的耐藥水平外，mtrR對rpoH表達的調節可能對體內的淋球菌生存有重要意義，即mtrR可能調節淋球菌抵抗機體固有防御系統中性粒細胞的氧化和非氧化殺傷系統發揮一定作用。同時還發現淋球菌基因hsp33受mtrR的管制，前者編碼的Hsp33在淋球菌中可能與對溫度升高及過氧化物的反應有關，與grpE不同的是mtrR對hsp33的抑制可能是直接的，兩者結合點由31個bp組成，從核苷酸110到141。對于淋球菌來說，mtrR表達似乎是一個劣勢，因為它的存在會降低對排出抗生素藥物所需要基因的表達。但同時淋球菌mtrR也可以轉錄激活某些涉及新陳代謝基因，例如:abpE、glnE和rfbB，來幫助淋球菌在機體中生存[17]。Shafer研究小組對FA1090株全基因組序列分析發現一個開放的閱讀框架(NGO 1360)，位于mtrCDE操作子下游的943 bp。GdhR屬于細菌的GntR蛋白家族，它是基因調節因子，含有高度保守的N端DNA結合區和一個參與效應結合及低聚反應的可變C端結構域。鑒于gdhR靠近mtr位點，研究者鑒于mtrR在調節淋球菌對抗菌藥物的耐藥性中的重要作用、對代謝相關基因的調控、對實驗感染模型中淋球菌適應度的影響以及與gdhr的接近性，假設gdhR和mtrR分別對mtr和gdh基因位點具有交叉調節作用，經過驗證并未發現GdhR調控mtrCDE或抗菌耐藥性的證據，但實驗中發現缺失GdhR的菌株在感染雌性小鼠下生殖道時的體內適應性明顯提高[18]。在對淋球菌耐藥機制研究中發現，mtr系統所發揮作用顯而易見，從生態學角度來看，淋球菌外排系統可為其在不利的生存環境中提供一個生存優勢。

2 MacAB外排泵

在2001年發現大腸桿菌有一種可以識別大環內酯類抗生素的ATP轉運蛋白，并將其命名為MacAB[19]。有研究通過對淋球菌FA1090基因序列的分析，發現兩種開放的閱讀框架(ORFs)即macA，macB編碼兩種蛋白，與大腸桿菌MacA，MacB分別具有35.1%、51.1%的同源性。MacA屬于MFP家族，MacB是一種具有ATP結合域的完整膜蛋白質。Corinne E等發現在位于macA基因ATG的上游37 bp處有一個C核苷酸的轉錄起始點，在這個轉錄起始點上游有7個堿基對是一個假設啟動子，接近-10序列(TAGAAT)和-35序列(TTGGAT)間。-10的hexamer序列中的G核苷酸是在淋病和腦膜炎球菌序列上的macAB啟動子序列的特征，對macAB的轉錄有抑制作用。為證明對于淋球菌除了Mtr外排系統，還有MacAB參與大環內酯類抗生素的耐藥，使用操縱子插入突變及啟動子錯義突變法加強MacAB的表達后可以增強對大環內酯類抗生素的耐藥，作者推測MacAB具有識別大環內酯的能力，然而，其對大環內酯類淋球菌耐藥性的貢獻被MtrCDE泵的存在所掩蓋，對于一些含有對mfc基因或rRNA甲基化酶基因的菌株來說也可能是如此，后者提供了比MtrCDE泵更高的大環內酯抗性水平[20]。

3 FarAB

FarAB(fatty acid resistance)是在男男性接觸者淋病患者直腸感染灶中分離出的菌株上發現，這些菌株表現對具有潛在抗菌活性的長鏈脂肪酸如亞麻脂酸、棕櫚脂酸、油脂酸等的抵抗，但這些菌株并不一定對脂溶性抗生素耐藥，在之前研究中淋球菌對脂溶性抗生素耐藥是由mtr外排系統導致的，因此推測淋球菌還有一種外排系統。1999年Ham等首先克隆并鑒定了另外一種外排系統FarAB，并證明淋球菌對上述長鏈脂肪酸耐藥是由該系統導致的。FarAB外排系統是由淋球菌染色體DNA編碼的基因組，包括兩個串聯的開放閱讀框farA和farB。farA為一個含有394個氨基酸殘基的蛋白,在氨基酸序列上，farA與大腸桿菌的EmrA和霍亂弧菌的VceA均為MFPs家族成員，但與同源蛋白相比，farA蛋白的N末端缺失一段信號肽片段，farA位于淋球菌細胞壁間質中，作為間質外排蛋白而發揮其功能。farB與大腸桿菌EmrB和霍亂弧菌的VceB分別有57.7%和38.7%的同源性，上述三種蛋白也同屬于MF家族。farB亦為一胞膜主要蛋白，結構分析顯示farB的氨基酸序列包含14 個跨膜螺旋，farB的作用底物通常是一些長鏈脂肪酸。Far外排系統缺乏一個與其共轉錄的外膜外排蛋白，研究發現，mtrE失活時 farAB導致的抗脂酸活性喪失，因此確定mtrE作為farAB外排系統的外膜通道蛋白，形成一貫穿細菌膜壁的外排通道結構即farA-farB-MtrE發揮外排作用[21]。

雖然farAB系統與大腸桿菌的emrAB同源，emrAB基因上游存在一個調控基因emrR，該基因編碼一種轉錄調控蛋白EmrR調節emrAB的轉錄，但在farAB上游并不存在這一類似序列，在farAB系統存在著屬于MarR家族的轉錄阻遏蛋白FarR，其可以負調控FarAB蛋白的表達。Shafer等發現farAB系統仍需MtrE外膜通道蛋白的協助對抗生素起作用，其呈串聯連接的兩基因farA和farB的表達似乎與mtrR蛋白的水平呈正相關，而mtrR蛋白通常被認為是mtr系統的轉錄抑制子，而且farAB上游啟動子區內包含一段類似于mtrR特異結合位點的序列，這些似乎說明farAB系統受到mtrR蛋白的直接性正性調節，隨后的試驗證實，mtrR并不能特異的結合到這一序列上，但它可負調節FarR蛋白的表達而間接上調fabAB的表達[22]。

4 NorM外排泵

Shafer等在發現淋球菌擁有兩種外排泵后，即屬于RND家族的mtr外排泵系統和屬于MF家族的FarA-FarB外排泵系統，又發現淋病奈瑟菌及腦膜炎奈瑟菌上存在另一種外排轉運蛋白，因其與副溶血性弧菌的NorM同源，因此稱之為NorM。通過分析發現NorM蛋白可以增加一些沒有被mtrCDE和FarAB所識別的一些化合物，例如：溴化乙錠(EB)、鹽酸吖啶黃(AFh)、2-N-methylellipticinium (NME)和黃連素(BE)。并且發現NorM基因上游的一個點突變可以導致其過度表達，從而降低奈瑟菌對諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)和苯甲氯銨(BC)的敏感性[23]。

NorM在淋球菌細胞膜是以Na+作為能量來源，Lu等認為，Na+通過誘導蛋白質構象變化而觸發多種藥物的擠壓，而不是直接競爭底物結合的氨基酸。與其他多藥轉運蛋白如：p-糖蛋白(ABC家族)和EmrE(SMR家族)相比較，這些多藥轉運蛋白使用大量的疏水化合物，特別是芳香氨基酸將底物固定在一個相對大的疏水腔內，而淋球菌的NorM是用少量的疏水殘留物用于藥物底物的結合。此外，至少有3個酸性殘余物被用來抵消底物，這可能是阻止通過蛋白質的結合和運輸所必需的負電荷或電子合成物，從而賦予了底物的特異性[24]。

5 MtrF AbgT

淋球菌外排泵系統的另一個內在膜蛋白MtrF，屬于AbgT的轉運蛋白家族。已經發現MtrF與mtrCDE結合，通過一種未知的機制來排出某些抗菌藥物。在革蘭氏陰性細菌如沙門氏菌、革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌等以及酵母等酵母均可發現AbgT蛋白。研究者最初在mtrR基因的下游定位mtrF，它被預測編碼56.1 kDa的細胞質膜蛋白質，包含12個跨膜域。大腸桿菌AbgT蛋白已被證明能催化葉酸分解代謝物-氨基苯甲胺-谷氨酸鹽的吸收和分解，并可以從分解葉酸的合成中導入分解代謝物氨基苯甲酰亞胺。因此推測淋球菌MtrF蛋白也有可能作為一個輸入通道，吸收對氨基苯甲酸鹽和相關的小分子合成基本的葉酸。MtrF的外排作用也體現從細胞中清除磺胺類抗生素，并調節細菌對這類抗生素的耐藥性[25，26]。

MtrF是一種522種氨基酸的晶體結構，其不對稱的單元包含兩個MtrF分子，以二聚物的形式聚集在一起。MtrF二聚體晶體結構表現為一個碗狀凹形結構。MtrF的每個子單元由9個螺旋形的跨膜段和兩個螺旋發夾組成。有研究者推測MtrF可能是一種能識別和擠壓磺胺類代謝物的藥物泵，能量來源于質子驅動。有研究已經確定影響mtrF表達的兩個抑制因子，即MtrR和MpeR。在缺乏MtrR和MpeR的菌株中，mtrF的表達比單一突變出現時增強。MtrR和MpeR對mtrF的抑制是附加的，與 MtrR對mtrF表達的抑制是分別獨立存在的。mpeR基因被限制為具有致病性淋球菌特有的，并受到淋球菌鐵轉運過程中的鐵吸收調節劑和鐵的負性調節。Hollander等發現MpeR直接激活菌株的fetA基因，后者編碼的FetA是一種表面暴露的腸類星狀鐵體的受體，是一種由淋球菌所使用的受體復合體的外膜轉運體，以獲得由其他細菌產生的鐵。FetA也在腦膜炎奈瑟菌中存在，并具有免疫原性，從腦膜炎球菌病患者的康復期血清中出現抗fetA抗體與淋球菌有交叉反應[27-29]。

6 MtrA AraC

Rouquette等[30]報道了另一種調控基因MtrA，其編碼的蛋白MtrA屬于Arac/Xy1轉錄活化子家族,此調控蛋白可上調mtrCDE的表達,這樣Mtr系統就同時受到MtrA和MtrR的正負雙重調。這些表型典型的HAs敏感的淋球菌可以使用一種依賴于MtrA依賴性的途徑來增強其在感染過程中遇到的阻力。在進入其他有缺陷的位點后，通過MtrR轉錄抑制因子的作用，可以逆轉由外泵蛋白的過度表達所產生的負生長影響[30，31]。針對922株淋球菌測序發現野生型的MtrA存在穩定，并且多數菌株可能通過MtrCDE顯示誘導抗菌素耐藥性的能力[32]。

H041轉化株菌株缺失MtrCDE泵顯示對青霉素、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、四環素、索利霉素敏感度顯著增加。將H041繼續轉化缺失MacAB的H041變異株分別增加了4倍和2倍的阿奇霉素和頭孢菌素的敏感性，而H041轉化成缺失NorM的變異株索利霉素敏感性增加32倍。與只缺少MtrCDE泵的突變體相比，多泵的損失并沒有顯著增加易感性[33]。

綜上所述，淋球菌外排系統涉及多種家族蛋白，其外排因素造成耐藥的原因復雜，可以單一外排泵作用也可能多種聯合作用，互相之間關聯與調控值得進一步探究。目前臨床尚未有針對淋球菌外排泵抑制劑的藥物。因此，針對淋球菌外排泵所開發的相應抑制劑對于淋球菌感染的治療而言有著深遠的意義。