柴油降解菌的篩選及降解柴油方法的研究進(jìn)展

張 瑤，湯眾如，汪 濤，曹 迪，董 程

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163000；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江大慶 163000）

當(dāng)前使用最多的發(fā)動(dòng)機(jī)燃料之一是柴油，社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展使得柴油的需求量逐漸增加，土壤環(huán)境、生活環(huán)境均由于人類對(duì)柴油不合理利用所污染。柴油主要以溶解態(tài)、自由態(tài)、揮發(fā)態(tài)和殘余固態(tài)存在于土壤中，破壞了土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)；同時(shí)造成地下水系統(tǒng)污染，威脅著動(dòng)植物的生存。2015年首次公布全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)顯示，在13個(gè)采油區(qū)的494個(gè)土壤點(diǎn)中，23.6%為超標(biāo)點(diǎn)位，主要污染物為石油烴和多環(huán)芳烴[1]。因此，污染土壤的修復(fù)與治理目前已成為最引人關(guān)注的話題之一。生物處理具有節(jié)約能源、投資少、運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是柴油污染土壤處理的理想方式。

土壤中存在可利用有機(jī)物的微生物，它們具有氧化分解有機(jī)物的能力。在許多條件下，降解菌馴化時(shí)間長(zhǎng)、生長(zhǎng)慢、代謝活性低、不穩(wěn)定，所以篩選穩(wěn)定高效的降解污染物菌株，是生物修復(fù)的必然要求。不同油區(qū)的微生物菌種不同，最適的培養(yǎng)條件也不同，所以對(duì)于土壤修復(fù)技術(shù)來(lái)說(shuō)，高效降解菌的篩選是必要的。

1 柴油降解菌的篩選

1.1 采樣

柴油降解菌的篩選首先需要找到污染土源。污染土壤主要有2種來(lái)源：一是直接在柴油污染地采取污染土樣，如胡春輝、呂乾川等人[2-3]的研究；二是利用人工模擬柴油污染土壤作為污染土樣，當(dāng)用人工污染土樣時(shí)，污染程度和條件的設(shè)置需要考慮被修復(fù)土壤的自然環(huán)境條件，如孫秦川等人[4]是將混有柴油的土壤放置到一定深度的污染地層。由于直接使用污染土壤篩選的菌株缺乏柴油針對(duì)性，而直接用人工模擬柴油污染土壤可能又會(huì)使篩選出的菌株脫離真實(shí)環(huán)境，使其無(wú)法在野外大量生存。所以，該研究更傾向于將兩者結(jié)合，即先在柴油污染地取一定量的污染土，再加入一定比例的柴油混勻，最后將混勻后的污染土壤放置到有一定深度的柴油污染地，經(jīng)一段時(shí)間后挖出，作為柴油污染土樣。

1.2 篩選

柴油污染土樣制備完畢后，要進(jìn)行菌株的篩選和純化。實(shí)驗(yàn)室篩選菌株的一般步驟如下：①土壤樣品富集培養(yǎng)；②涂布培養(yǎng)：樣品稀釋、涂布、恒溫培養(yǎng)；③劃線培養(yǎng)：包括交叉劃線法、三區(qū)劃線法等；④鏡檢：涂片、染色、觀察。菌株的篩選操作簡(jiǎn)便，其區(qū)別之處在于涂布培養(yǎng)過(guò)程中固體培養(yǎng)基的選用不同。大多數(shù)應(yīng)用的有2種：一是以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基，如馬曉焉等人[5]用到的固體油培養(yǎng)基；二是不添加油的固體培養(yǎng)基，如胡春輝和呂乾川等人[2-3]用的是LB固體培養(yǎng)基。這2種固體培養(yǎng)基試驗(yàn)更傾向于前者，在試驗(yàn)過(guò)程中，用一種土樣分別在2種固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)降解率的測(cè)定顯示，降解率最高的5株菌均是用固體油平板篩選出來(lái)的。將固體培養(yǎng)基中的碳源設(shè)置成僅由柴油提供，可以提高菌株篩選的針對(duì)性，為挑選降解率更高的菌株提供更大的可能性。

2 降解柴油的方法

利用篩選得到的柴油降解菌株降解柴油，可以使用不同的方法來(lái)提高降解率，從而達(dá)到最佳的降解效果。

2.1 單一菌株與復(fù)合菌群

柴油是一種混合物，輕質(zhì)的石油類產(chǎn)品，復(fù)雜烴類混合物，飽和烷烴大約占89.6%，芳香烴大約占8.0%，柴油中還有少量的醇、烯、酸等氧化物。面對(duì)成分復(fù)雜的柴油，單菌株無(wú)法完全完成柴油降解的過(guò)程，只有使具有不同能力的微生物共同發(fā)揮作用，構(gòu)成復(fù)合菌群，才可能實(shí)現(xiàn)柴油的完全降解。各菌株間一般存在協(xié)同與拮抗作用，在構(gòu)建復(fù)合菌群時(shí)，需要考慮各菌株之間的相互關(guān)系。將降解不同組分的菌株復(fù)配在一起，可以提高降解菌株對(duì)柴油降解的效率。如陸泅進(jìn)等人[6]混合菌群的柴油降解率較之單一菌株要高。

篩選得到的柴油降解菌株除了可以直接降解柴油外，無(wú)論是單一菌株還是復(fù)合菌群，都可以在原菌株的基礎(chǔ)上對(duì)菌株進(jìn)行基因改造，或者使單一菌株、復(fù)合菌群與植株復(fù)合降解柴油，這都可以增加柴油的降解率。例如，周翔等人[7]通過(guò)重離子束輻射得到了突變菌株DMYR9，使得污染土壤的修復(fù)效果明顯增強(qiáng)；陸泅進(jìn)等人[6]通過(guò)試驗(yàn)證明了苜蓿和芥菜都能顯著地強(qiáng)化菌株Q18對(duì)柴油的降解，菌群和苜蓿及芥菜復(fù)合體系降解柴油的能力也高于菌群對(duì)柴油的降解。

2.2 表面活性劑

表面活性劑通過(guò)3種途徑來(lái)提高柴油污染土壤的生物可利用率[8]：①增大微生物細(xì)胞與油滴的直接接觸的方法；②減小油滴的直徑，通過(guò)增溶作用，使有機(jī)分子溶解在膠束中，使水相中的油相分散，有利于微生物吸收比自身大小小的液滴；③改變細(xì)菌細(xì)胞的表面特征，添加低濃度的表面活性劑能使細(xì)菌細(xì)胞表面更加疏水，增加細(xì)胞與石油烴污染物之間的親和力，從而提高細(xì)菌降解柴油污染土壤的能力。

杜海、李玉瑛等人[9-10]的試驗(yàn)中，表面活性劑無(wú)論是單一添加還是復(fù)合添加都能有效提高降解率，且他們均在測(cè)定降解率前將各表面活性劑對(duì)各自菌株的影響進(jìn)行了報(bào)告，通過(guò)毒性試驗(yàn)確定表面活性劑的用量，盡可能提高菌株對(duì)柴油的降解率。在篩選菌株時(shí)，也可以直接挑選生產(chǎn)表面活性劑的菌株。

2.3 生物修復(fù)與物理修復(fù)的結(jié)合

利用微生物降解柴油，除了通過(guò)添加表面活性劑提高降解率外，還可以通過(guò)改變外界環(huán)境來(lái)提高微生物的降解作用。生物通風(fēng)法是一種土壤原位修復(fù)的方法，將生物修復(fù)方法與物理修復(fù)方法相結(jié)合，其技術(shù)基礎(chǔ)是土壤氣相抽提技術(shù)。生物通風(fēng)法將空氣或氧氣通過(guò)低速的通風(fēng)速率輸送到地下環(huán)境，促進(jìn)生物好氧降解的作用，達(dá)到降解有機(jī)物的目的。還有研究者通過(guò)生物通風(fēng)技術(shù)對(duì)修復(fù)不同程度的柴油污染土壤的土柱模擬試驗(yàn)，研究了各土柱中土壤總石油烴的去除規(guī)律，并對(duì)影響柴油去除效果的因素進(jìn)行了分析，為研究不同土壤中柴油的生物降解作用提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)語(yǔ)

污染土壤防治行動(dòng)計(jì)劃的發(fā)布和實(shí)施，是對(duì)柴油污染土壤修復(fù)工作的新要求和新目標(biāo)。修復(fù)柴油污染土壤的物理、化學(xué)方法雖然具有修復(fù)周期短的特點(diǎn)，但存在修復(fù)不完全和容易造成二次污染等缺點(diǎn)；生物修復(fù)技術(shù)以其不產(chǎn)生二次污染、成本低等特點(diǎn)，近年來(lái)被大范圍推廣使用。但是，生物修復(fù)技術(shù)也有一定的局限性，首先是時(shí)間，想要達(dá)到預(yù)期目標(biāo)需要付出長(zhǎng)達(dá)幾年的時(shí)間來(lái)完成；其次，高濃度的柴油污染物可能會(huì)使微生物的生存受到影響，自然環(huán)境的多變性同樣會(huì)影響菌群的降解率。這些生物修復(fù)的局限性也預(yù)示著未來(lái)生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展。

隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)柴油的生物降解的研究已經(jīng)從宏觀層面（如菌株篩選鑒定），到了微觀的分子水平（如基因的修改）。修復(fù)柴油污染土壤的技術(shù)誕生了很多，但是技術(shù)革新是很重要的，生物修復(fù)和物理修復(fù)或化學(xué)修復(fù)結(jié)合的技術(shù)也將成為修復(fù)柴油污染土壤的趨勢(shì)。