濃縮蘋果汁中微生物染菌的種類及防治研究

王 楠，臧汝瑛，周宏霞

（威海市食品藥品檢驗檢測中心，山東威海 264209）

蘋果是我國廣泛栽培的一種水果，深受廣大消費者喜愛。蘋果中的營養成分及功能性成分種類眾多，有糖類、果膠、纖維素、有機酸、單寧及各種金屬離子，具有補中益氣、開胃制酸、潤肺悅心等功效[1]。在我國，蘋果除了部分鮮食外，大部分通過蒸發濃縮或者膜分離加工成濃縮蘋果汁，進而制作成各種飲料[2]。

濃縮蘋果汁的終點質量分數一般為40%～50%，目的是為了便于運輸，以及增加滲透壓不容易染菌[3]。然而，微生物染菌僅僅是相對的，在濃縮蘋果汁的運輸及貯藏過程中，出現酒味的現象往往意味著其中有了微生物在發酵，如果不能及時加工成產品，酒味會轉變成酸味，甚至不良的臭味[4]。微生物染菌現象在炎熱的夏季尤為嚴重，一直是果汁工業要努力解決的難題。試驗對濃縮蘋果汁中的微生物進行了分離培養，確定了容易染菌的種類，并對其防治措施進行了初步研究，對于濃縮果汁的保鮮具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

濃縮蘋果汁，購于威海農貿市場；納他霉素，由浙江新銀象生物工程有限公司提供；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、焦亞硫酸鈉等試劑，均為分析純。

瓊脂培養基[5]：葡萄糖10 g/L，酵母抽提物2 g/L，胰蛋白胨5 g/L，瓊脂20g/L，初始pH值7.0。于121℃條件下滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果汁中微生物的培養

在超凈工作臺中傾倒瓊脂平板，備用。用移液槍吸取濃縮蘋果汁200 μL涂布平板，槍頭事先滅菌并用脫脂棉包口。平板倒扣于恒溫培養箱中，于35℃條件下培養36 h，觀察平板菌落情況。

1.2.2 搖瓶培養微生物并顯微鏡觀察[6]

用接種環挑取單菌落2環至滅菌的液體培養基中，液體培養基的成分與瓊脂培養基相同，但不含瓊脂。于35℃條件下搖床培養，轉速200 r/min，培養時間24 h。培養完畢后吸取1滴菌液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在10×40倍的顯微鏡下觀察微生物的形態。

1.2.3 焦亞硫酸鈉對酵母菌的抑制效果[7]

液體培養基滅菌后，吸取不同量的焦亞硫酸鈉濃溶液至搖瓶中，使其總使用量分別為300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，再接種1 mL的酵母菌液作為種子，并以不加焦亞硫酸鈉作為對照，于35℃條件下搖床培養，轉速200 r/min，培養時間24 h，觀察酵母菌的增殖情況。

1.2.4 納他霉素對酵母菌的抑制效果[8]

液體培養基滅菌后，吸取不同量的納他霉素濃溶液至搖瓶中，使其總使用量分別為2×10-6，5×10-6，10×10-6，再接種1 mL的酵母菌液作為種子，并以不加納他霉素作為對照，于35℃條件下搖床培養，轉速200 r/min，培養時間24 h，觀察酵母菌的增殖情況。

2 結果與分析

2.1 濃縮蘋果汁中微生物的平板培養

根據濃縮蘋果汁的貯藏時間，先后取樣進行了微生物的培養，其貯藏時間分別為7，15，30，50 d。首先從氣味方面考查，貯藏7 d的果汁沒有明顯的酒味，也沒有異味，但是在培養微生物的平板上仍然有菌落生長，見圖1（a），而且在平板上卻產生了明顯的酒精味，說明染菌大部分是酵母菌，同時也有少量霉菌生長出來，且通過平板計數，酵母菌數量占比約80%。貯藏了15 d的果汁，生長出的酵母數量要比7 d的多，見圖1（b），約為600個/mL，基本上全是酵母菌，霉菌沒有生長出來。而對于存放30 d和50 d的蘋果汁，其酒精味很濃烈，說明酵母菌增殖到了一定程度，已經嚴重引起了果汁的質變，微生物培養結果也證實了這一點，酵母菌數量高達3 000個/mL，見圖1（c） 和圖1（d）。

從濃縮蘋果汁中培養出的微生物菌落見圖1。

2.2 搖瓶培養濃縮蘋果汁中的微生物

圖1 從濃縮蘋果汁中培養出的微生物菌落

將平板上的部分單菌落接種至搖瓶中進行液體培養，以觀察微生物的類型。結果發現，從蘋果汁中分離出來的微生物增殖能力很強。由圖2（a） 可知，剛剛接種菌液時的液體培養基依然很清亮透明，說明微生物的數量還比較少，然而僅僅經過了24 h的培養，各個搖瓶中的培養基變得非常渾濁，見圖2（b），OD值從初始的0.4急劇升高至42.5。果汁中染菌微生物的增殖能力強，也從側面證實了控制果汁保鮮的難度較大。

搖瓶培養微生物的增殖情況見圖2。

圖2 搖瓶培養微生物的增殖情況

從搖瓶培養基的氣味考查，每瓶都散發著濃濃的酒精味，還夾雜一些其他芳香氣味，但是每瓶中的氣味也有差異。通過顯微鏡觀察，基本確定染菌的大多數是酵母菌，但是酵母菌的種類和形態并不單一。

顯微鏡觀察搖瓶中微生物的形態見圖3。

圖3 顯微鏡觀察搖瓶中微生物的形態

由圖3可知，有的酵母菌呈橢球狀，見圖3（a）；有的呈球形，見圖3（b）；有的呈長桿狀或者節狀，見圖3（c）。對于圖3（d），其中的微生物種類繁多，呈絲狀的是霉菌，大球形的是酵母菌，而非常細小的呈點狀的則為細菌類。總之，通過對濃縮果汁中染菌微生物的調研，可以得知其中數量最多的是酵母菌，占總菌落數的80%；霉菌數量次之，占15%；而細菌類數量最少，占5%。

2.3 焦亞硫酸鈉對酵母菌的抑制作用

既然清楚了濃縮蘋果汁容易染菌，也對其中的微生物種類進行了調研，接下來對濃縮果汁的防腐保鮮作了進一步研究。目前，果汁在運輸及貯藏中常用的抑菌劑是焦亞硫酸鈉（簡稱焦亞）。焦亞的化學式是Na2S2O5，是一種酸性物質，一般認為其防腐抑菌機理是與水反應放出SO2，進而生成亞硫酸[9]。根據GB 2760對于焦亞的使用規定，焦亞在果蔬汁中的最大使用量為0.05 g/kg，濃縮果蔬汁按濃縮倍數折算，估算約250×10-6。為了確定焦亞是否對濃縮果汁中的酵母菌有抑制效果，研究對其使用量進行了試驗[10]。

不同焦亞硫酸鈉使用量對酵母菌的抑制作用見圖4。

圖4 不同焦亞硫酸鈉使用量對酵母菌的抑制作用

由圖4可知，焦亞的使用量分別為0，300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，接種酵母菌經過 24 h培養后，對照組（0） 搖瓶中的菌液非常渾濁，OD值為46.3。焦亞使用量為300×10-6的試驗組，從外觀上看與對照組區別不大，OD值為42.7，說明焦亞幾乎沒有發揮出抑菌作用。當焦亞使用量達到500×10-6時，試驗組搖瓶的OD值為38.2，雖然能夠體現出其對酵母菌有所抑制，但很明顯抑菌效果并不強烈。甚至當焦亞使用量高達1 000×10-6時，OD值也只是降低至21.6，遠遠沒有達到試驗預期的抑菌效果。這實際上是我國食品工業中防腐劑使用的一個縮影，即在國標規定的范圍內，很多防腐劑達不到理想的抑菌效果[11]。

2.4 納他霉素對酵母菌的抑制作用

納他霉素是一種微生物發酵生產的防腐劑，其專一性的抑制酵母和霉菌，具有良好的物理和化學穩定性，與乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸一起稱為三大生物型防腐劑[12]。根據我國GB 2760規定，納他霉素可以應用于干酪、肉制品、糕點、果蔬汁等食品的防腐中，在果蔬汁中的使用量最高為0.3 g/kg，即300×10-6；在發酵酒中的使用量最高為0.01 g/L，即10×10-6。為了確定納他霉素是否對濃縮果汁中的酵母菌有抑制效果，研究對其使用量進行了試驗[13]。

不同納他霉素使用量對酵母菌的抑制作用見圖5。

圖5 不同納他霉素使用量對酵母菌的抑制作用

由圖5可知，納他霉素的使用量分別為0，2×10-6，5×10-6，10×10-6，接種酵母菌經過 24 h培養后，對照組（0） 搖瓶中的菌液非常渾濁，OD值為44.8。納他霉素使用量為2×10-6的試驗組，從外觀上看與對照組有明顯不同，還是呈現剛接種時澄清的狀態，其OD值從初始的0.45僅僅增長至0.84，說明納他霉素對酵母菌的抑制作用非常強烈，僅僅2×10-6就達到了理想的效果。后續2個試驗組，使用納他霉素5×10-6和10×10-6的搖瓶中，酵母菌同樣也沒有繁殖起來，OD值分別為0.82和0.78。這說明納他霉素可以作為濃縮蘋果汁保鮮的有效防腐劑。

3 結論

濃縮蘋果汁的質量分數一般為40%～50%，鑒于濃縮技術及質量指標，其質量分數不能再高，因此相比于果葡糖漿或者麥芽糖漿75%的質量分數，濃縮果汁質量分數偏低。而且由于蘋果汁中含量較高，大部分糖分為葡萄糖、果糖、蔗糖等，均為易發酵成分[14]，所以在運輸及貯藏過程中容易發生染菌。研究發現，濃縮蘋果汁中染菌微生物絕大多數為酵母菌，少數為霉菌，而細菌類數量較少。針對于酵母菌和霉菌，研究選擇了專一性的抑菌劑納他霉素，使用量僅僅2×10-6即表現出了強烈的抑菌作用和防腐效果，這就為濃縮果汁的保鮮提供了有效的解決方案。此外，從應用成本角度考慮，納他霉素的市場價格以500元/kg計算，即使按照5×10-6的使用量，每1 m3果汁中納他霉素的使用量為5 000 mg，即5 g，折合成本為2.5元/m3，這對于果汁工業是很容易接受的。而且，納他霉素作為一種安全、高效的食品防腐劑，將會在食品工業中發揮越來越重要的作用[15]。