內生菌對葡萄生長發育及釀造的影響研究進展

南立軍，李雅善，崔長偉，寧娜，楊俊梅，徐成東*，范樹國，許碩星

（1. 楚雄師范學院化學與生命科學學院/楚雄師范學院高原特色葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，云南楚雄 675000；2. 昆明理工大學云南省食品安全研究院，云南昆明 650550）

葡萄酒顏色的穩定性是葡萄酒的重要特征之一，葡萄酒從貯存、運輸到貨架期間顏色、口感和香氣的平衡，及葡萄酒的營養、健康與安全都受到葡萄酒顏色穩定性的影響。因此，生產顏色純正且穩定的葡萄酒是保證葡萄酒質量的關鍵瓶頸。

葡萄酒發酵過程是由各類微生物和酶參與的復雜的生化反應過程[1]。在葡萄酒發酵過程中，葡萄梗、籽、皮和果肉中的糖、酸、色素、單寧、蛋白質、膠體和香氣物質等通過浸漬、發酵和生化反應等相互滲透、結合、分解、轉化[2]，導致葡萄酒顏色處于動態變化之中。發酵結束后，少量的微生物和酶在陳釀階段仍然殘存在葡萄酒中，繼續分解、代謝和轉化葡萄酒中的成分。經過一段時間陳釀后，微生物和酶代謝底物基本被消耗殆盡，繼續代謝其它的物質或副產物[3]，這些持續不斷的代謝活動引起葡萄酒顏色的變化。因此，葡萄酒陳釀期間顏色的變化起源于葡萄酒的發酵，一直延續到葡萄酒的陳釀，直至貨架期。發酵結束后的陳釀期仍然伴隨著漫長的各類微生物參與的生化反應過程，使葡萄酒處于動態狀態——香氣、色澤和口感等外部感官特征和內部成分之間的動態發展之中。

內生菌（Endophytic）是由外源微生物侵入并在長期的共生過程中形成的內生細菌、內生真菌和內生放線菌，一般不引起明顯病害癥狀[4-5]。內生菌作為重要的微生物，目前研究較多的是對葡萄中產白藜蘆醇內生菌的篩選和特性的研究。白藜蘆醇作為重要的酚類物質，與葡萄和葡萄酒中的色素類物質反應，可以改變葡萄酒的顏色[6-7]；內生菌除了產白藜蘆醇之外，也產色素類物質或者與色素類物質結合或反應的相關物質，影響葡萄酒的顏色，究竟是哪一類內生菌產色素類物質，需要進一步研究。葡萄酒陳釀是一個多種微生物共存的復雜過程。葡萄酒顏色通常會隨著陳釀明顯降低，影響因素有哪些？內生菌如何影響葡萄酒陳釀期間顏色的變化？如何通過內生菌調節葡萄酒顏色的變化？需要科學系統地研究，揭示規律，趨利避害，保持葡萄酒的穩定。

我國各產區風土特點突出，四季分明、晝夜溫差大，其獨特的風土和自然環境條件在決定葡萄酒優良品質的同時，也極大地影響了葡萄酒顏色的變化。篩選和確定高產和穩定色素類物質的內生菌及其菌落構成，結合內生菌的次級代謝作用及其機理研究葡萄果實中各成分之間的轉化、紅葡萄酒釀造和陳釀期間代謝指標和顏色指標的變化對紅葡萄酒顏色變化的影響，分析確定紅葡萄酒貯藏期間顏色穩定的原因，最終揭示內生菌對紅葡萄酒貯藏期間顏色的穩定性機理，為進一步研究奠定基礎。因此，釀酒葡萄內生菌的篩選及其研究開發對于葡萄酒顏色的穩定和質量安全有重要的現實意義。

1 國內外研究現狀及發展動態分析

葡萄及其產品葡萄酒主要由水、糖、酸、色素類、酚類、蛋白質、膠體、香氣物質及礦物質等組成，這些物質之間相互溶解、分解、結合、轉化，影響葡萄和葡萄酒顏色的變化。因此，葡萄和葡萄酒的顏色與這些成分息息相關。目前國內外相關的研究主要集中在以下幾個方面：

1.1 內生菌的特性及功能

近年來，有關內生菌的研究主要集中在植物內生菌的多樣性、影響寄主植物生理生化的內部機制、與寄主植物相互作用產生活性次級代謝產物的開發利用等方面。內生菌還能影響葡萄離體細胞的生理生化狀態，但是不同內生菌的影響效應不同。

目前的研究發現，內生菌能產木質素酶、酚氧化酶、纖維素酶和漆酶等，分泌化感物質抑制其它植物生長，產生大量有機物并降解有害物質；產生多種抑制酵母菌和霉菌生長的有益物質和具有抑菌活性和化感作用的次級代謝產物及抗氧化物質。有些內生菌寄生在多種寄主體內，有些僅出現在某種或幾種特定寄主體內，極少數幾種具有寄主專一性。這些內生菌與寄主形成互利共生關系，誘導寄主植物產生高活性的次級代謝產物，同時提供活性物質，參與活性成分合成，轉化次級代謝產物，為發掘新的生物活性物質奠定了基礎。這些內生菌通過共生參與葡萄酒發酵和陳釀，產生各種生物活性物質，影響葡萄酒顏色的變化[8]。

內生菌的菌群組成具有多樣性。目前內生菌株篩選的目標主要是篩選產白藜蘆醇的內生菌株[9]。劉婭等[10]篩選出了高產白藜蘆醇的內生菌C2J6，并確定為黑曲霉。曾芹等[9]從釀酒葡萄‘美樂’的葡萄皮、穗軸及果梗中篩選出產白藜蘆醇的內生菌株，鑒定為鏈格孢屬菌。因此，內生菌在產白藜蘆醇方面有多樣性。王朝霞等從煙臺地區葡萄根部分離出了1331株19屬內生菌，其中以鐮孢屬Fusarium（33.9%）、Ilyonectria（17.35%）和柱孢屬Cylindrocarpon（15.7%）為優勢菌群[11]。在受污染的葡萄皮中也分離鑒定出了鐮刀菌，并篩選了10個降解酶類，其中的聚半乳糖醛酸酶和木聚糖酶能夠引起水果變質[12]。前人通過形態鑒定、排重、ITS排序、系統樹構建確定了釀酒葡萄的優勢菌群為青霉、交鏈孢霉、鐮刀菌，其中鐮刀菌屬的6株菌對3種指示菌均有抑制作用，具有抵抗釀酒葡萄病原真菌活性的作用[13]。研究發現，嫩葉內生菌的分離率和多樣性指數明顯低于成熟葉和老葉，這些內生菌通過葡萄成熟采收進入葡萄酒，影響葡萄酒品質[14]。Pamoda等[15]從仙人掌中分離的抗菌活性最強的鐮刀菌屬中分離的伊快霉素能夠幫助寄主抵御脅迫環境，起保護色作用。除此之外，安榮艷等[16]也初步篩選鑒定出用于“人工貴腐酒”釀造的灰葡萄孢菌株，為后續研究奠定了基礎。

內生菌的潛在危害也非常嚴重。多次傳代后，內生菌的代謝產物不穩定、生物特性退化[17]，引起葡萄酒顏色的嚴重退化，其機理需要進一步研究。內生菌種類和數量的變化會影響葡萄酒顏色的變化。綜上分析，內生菌來源廣泛，種類繁多，同一種內生菌能夠產多種活性物質；有些內生菌具有正面作用，有些具有負面作用，因此內生菌具有保護葡萄酒和污染葡萄酒的雙重作用，這與內生菌的作用機制有關。

1.2 內生菌與葡萄生長發育

“七分原料，三分工藝”。所以，葡萄酒品質主要由葡萄品質和釀酒工藝共同決定，而葡萄品質（葡萄中的糖、酸、酚類、蛋白質、維生素等成分）是決定葡萄酒品質的首要條件，影響其品質的因素主要有葡萄品種、環境條件、栽培措施等。因此，環境因子內生菌對葡萄品質有重要影響。內生真菌對葡萄葉片和果實中各生理生化指標也有影響，而且不同內生真菌的影響差異顯著。

崔艷莉等[18]采用組織塊培養法從‘赤霞珠’不同組織部位均分離到了內生酵母菌，初步鑒定為瓶形酵母（Pityros purom）和克勒克酵母（Kleckera），為國產內生酵母菌的篩選鑒定奠定了基礎。劉旭等[19]從染病葡萄植株的健康葉片中分離56株內生菌，從中篩選到對葡萄霜霉病（Plasmopara viticola）有明顯拮抗效果的菌株，并初步將其中的CS5菌株鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus amyloliquefaciens），為葡萄霜霉病菌的生物防治提供了基礎。王增福等[20]從釀酒葡萄植株的各組織中分離出的462株內生真菌中篩選出64株內生真菌。采用ITS排序、系統樹構建確定了20個屬釀酒葡萄內生真菌，其中包括3個優勢種群交鏈孢霉（Alternaria）、青霉（Penicillium）、鐮刀菌（Fusarium）；同時確定了對病原真菌有抗性的15個屬，其中鐮刀菌屬的6株菌對3種指示菌均有抑制作用，是釀酒葡萄植株主要抗病原真菌的因素之一，這為葡萄生物抗菌研究提供了基礎。申紅妙等[21]采用電擊轉化法將含有GFP基因的質粒pGFP78導入枯草芽孢桿菌JL4中，并成功得到表達GFP的生防菌JL4-gfp，同時采用葉片噴霧法接種、抗生素平板分離回收后發現，經過10次傳代培養后的標記菌株對葡萄霜霉菌保持原有的抑菌作用；定殖在葉片內部14 d后檢測不到接種菌株；噴霧3 d后的室內生防菌對葡萄霜霉病的防治效果達88.0%以上，但7 d后無明顯防效。JL4-gfp的定殖量與其防治葡萄霜霉病的效果呈正相關，這為明確枯草芽孢桿菌JL4在葡萄葉表面和內部的定殖情況，研究定殖與防治效果的關系提供了基礎。馬勉娣等[22]研究發現，再接種內生真菌改變了‘玫瑰蜜’葡萄葉片內生真菌的群落結構和分布，增加了‘玫瑰蜜’葉中內生真菌的數量和優勢度，降低了內生真菌的多樣性指數；噴施農藥提高了內生真菌的多樣性，但降低了內生真菌的分離率，表明再接種內生真菌能夠改善葡萄葉片的健康狀況，這對葡萄植株的生長和果實品質的改善有重要影響。黃治鈺[23]將分離、篩選出的9株內生菌接種于‘玫瑰蜜’葡萄幼葉，果實成熟后內生真菌對葉面積及新梢節間大小無顯著影響，但是不同菌株侵染顯著改變了葡萄葉片中原有內生菌群結構；葉片總黃酮、總酚和還原糖含量顯著降低，還原能力有所增強，VC含量有不同程度增加，總蛋白質含量有所降低；毛殼菌屬（Chaetomiumsp.）和炭角菌屬（Xylariasp.）能夠提高果實的體積和質量、果穗的整體成熟度；果實中，毛科菌屬使可滴定酸和總黃酮含量顯著增加；炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）顯著增加還原糖含量。康晶等[24]依次采用硫酸銨鹽析、疏水相互作用層析及離子交換層析從黑曲霉YY-22發酵產酸果膠粗酶液中分離較高純度的果膠裂解酶（PL）、聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠酯酶（PE），結果表明，65%硫酸銨對PL回收率最大，分離出部分雜蛋白；經Phenyl-Sepharose FF疏水相互作用層析分離出PE，又經Q-Sepharose HP交換層析分別得到PG和PL，為進一步研究酶的基本性質及其在葡萄酒中的應用奠定基礎。PL、PG和PE是葡萄中重要的三類酶，參與葡萄中重要色素類物質的分解和釋放[25]。這三類酶可以從黑曲霉YY-22中分離獲得。因此，黑曲霉YY-22是參與葡萄中重要色素類物質分解和釋放的重要內生菌。

總之，內生真菌可以在一定程度上改變葡萄葉片原有內生真菌的菌群結構，影響葡萄葉片和果實的生理生化狀態及葡萄品質。這些內生菌及其影響效應隨著葡萄酒釀造進入葡萄酒中，影響了葡萄酒發酵，甚至陳釀，這為進一步探討內生真菌對葡萄酒的品質調控效應和機制奠定了基礎。

因此，內生菌對葡萄葉片和果實的影響是非常顯著的，一方面，內生菌隨著發酵進入葡萄酒中，通過生化反應分解葡萄和葡萄酒中的成分影響葡萄酒的品質，另一方面，內生菌通過影響葡萄葉片和果實的成熟，影響葡萄中養分的積累，從而影響葡萄酒的品質。

1.3 內生菌與酚類物質的關系

1.3.1 葡萄酒中的色素類物質及其影響因素

葡萄酒中酚類物質對于葡萄酒品質至關重要。酚類物質具有促進和抑制葡萄酒氧化的雙重功能[26]。研究發現，在發酵和陳釀過程中，葡萄酒中的酚類物質相互聚合，或參與一系列復雜的生化反應，引起結構和含量的變化[27]。花色苷分子小、溶解度高、不穩定，可以自聚，與輔色素共呈色，或與乙醇、糖、肽和單寧類物質反應[28]。黃烷-3-醇類中的兒茶素、表兒茶素縮合成單寧在葡萄酒中聚合成原花青素，再與花色苷結合成聚合色素，酚酸（如咖啡酸、香豆酸等）與花色素和酒石酸結合，影響葡萄酒色度與顏色穩定性。山葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶顯著減緩總花色苷和二甲花翠素-3,5-雙葡萄糖苷的降解速率[29]。這些變化與花色素β環的羥基化形式有關。隨β環羥基數目增加，藍色會加深；而隨β環甲基化程度增強，紅色也會增強[28]，這與內生菌的作用密切相關。

陳釀期間酚類物質復雜多變。花色苷類賦予葡萄酒色澤，但是從陳釀開始緩慢下降[30]，這與蛋白質、多糖和濃縮單寧的沉淀作用及其不可逆的、復雜穩定的花色苷衍生物有關，也與由花青素或黃烷三醇縮合成的聚合物花青素及其衍生物有關[31]。游離花色苷降解或聚合色素導致酒體逐步由紅紫色漸變為磚紅色。游離花色苷能與多糖和肽反應，花色苷及其酰化物與其它酚類化合物形成結構復雜、穩定性較強的紅褐色或黃色聚合物，如吡喃花色苷和聚合色素。新葡萄酒中的花色素在陳釀期間結合成大分子縮合單寧，促進色素沉淀[32]。溶解氧會促進其聚合及氧化降解[33]。升溫和酒瓶頂隙體積的增加不利于刺葡萄酒中酚類物質保存，尤其不利于原花青素保存。偏低或偏高的游離SO2均不抑制游離花色苷的氧化降解，但是不影響花色苷-單寧聚合物褪色。因此葡萄酒顏色受多種因素的影響。

乙醛作為鍵橋能使微氧促進花青素與兒茶酚或單寧聚合[34]，降低單寧含量，避免SO2使花色苷脫色。微氧使乙醇和糖與花色苷反應，降低葡萄酒中總酚和游離花色素苷含量，提高酚類物質和顏色的穩定性[35]。研究發現，微氧對葡萄酒中酰化花色苷的影響強于游離花色苷，提高了葡萄酒穩定性[36]。因此，微氧能夠通過控制游離花色苷含量明顯控制葡萄酒中花色苷的變化。舊橡木桶陳釀的葡萄酒中游離花色苷含量比新橡木桶高，而新橡木桶中聚合花色苷的含量比舊橡木桶中高[37]。因此，橡木桶自身的特性能夠調節游離花色苷和聚合花色苷在葡萄酒中的比例，控制葡萄酒中花色苷的變化。

1.3.2 內生菌對葡萄酒顏色的影響

內生菌具有促進和抑制葡萄果實生長的雙重作用。內生菌能夠增加寄主對外界環境的應激耐受性、促進寄主植物生長及寄主中有效活性成分的合成[8]。葡萄皮中的內生菌隨著葡萄酒發酵進入葡萄酒，并長期貯存在葡萄酒中。

研究發現，米曲霉和米根霉發酵可以提高總黃酮含量[38]，而蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶對葡萄皮中總花色苷浸出率影響不顯著，纖維素酶對綠原酸浸出率效果最好，蝸牛酶對白藜蘆醇浸出率效果最好[39]，但是對游離花色苷如二甲花翠素、花青素、兒茶素和表兒茶素等的浸出作用未見報道。這些酶類都是與內生菌有關的生物活性成分，參與葡萄酒中色素類物質或者相關物質的合成、分解和轉化，因此也是葡萄酒顏色變化的重要因素。黃靜等[40]研究發現，發酵中止后冷藏更有利于多數游離酚類物質的形成和提高。基于此，應綜合考慮各個游離酚的性質，選擇適宜的浸漬時間和貯藏溫度，提高葡萄酒中酚類物質的含量，這與發酵工藝對游離酚和內生菌之間的相互作用有關。因此，內生菌對葡萄酒顏色的影響受多種因素的影響，研究這些因素對內生菌的多樣性影響是目前的研究趨勢。

酚類化合物可以通過促進或抑制酒酒球菌的生長和代謝影響二次發酵和葡萄酒的品質[41]，酒酒球菌可以通過葡萄糖苷酶代謝花色素或者其它酚類化合物產生葡萄酒中重要的風味物質[42]。這些微生物代謝和生化反應促進了葡萄酒的生長、成熟，也導致了葡萄酒的不穩定。因此，內生菌與酚類物質之間相互作用，影響葡萄酒顏色的變化。

1.4 內生菌的鑒定及分離方法

同位素示蹤法是一種十分有效的分析和鑒定工具，應用范圍非常廣泛，速度快、準確度高，可以準確跟蹤樣品中某些成分的變化。目前，主要是利用同位素質譜儀技術示蹤果實的生長狀況，鑒定葡萄酒的真假、產地、酒齡和物質結構的變化。花色苷（總花色苷和游離花色苷）的化學性質非常活躍，利用示蹤技術能夠準確及時跟蹤研究葡萄酒顏色的變化。有人利用同位素標記技術發現了內生菌與寄主之間存在著明顯的共生關系。Fadwa等[43]用13C標記和液相色譜-質譜技術確定了葡萄酒中多種真菌毒素，這一技術具有高度可靠性和準確度，值得在內生菌篩選和特性研究中推廣。也進一步證實花色苷與內生菌之間存在著密不可分的關系。

除此之外，抗藥性標記法也成功的用于檢測內生菌的定殖動態變化。通過目標細菌的自發突變或誘變，篩選出抗高濃度抗生素（如利福平、鏈霉素等）的突變體，再標記、回收、檢測。吳藹民等[44]用抗利福平法研究了內生菌73a的定殖消長動態。蔡學清[45]用雙抗標記檢測到枯草芽胞桿菌BS-2和BS-1的定殖動態。除了抗藥性標記法外，還有免疫學方法，如酶聯免疫吸附法（ELISA）、熒光抗體技術、Western印跡法、基因標記法、特異性寡核苷酸片段標記法等也廣泛應用于內生菌檢測。目前，GFP使內生菌檢測更加快捷，由于宿主生活環境多樣性以及內生菌與宿主關系的復雜性，有關內生菌定殖和分布的情況目前都是同時采用多種研究技術綜合分析。

2 結論

綜上所述，內生菌的來源和種類非常豐富。釀酒葡萄蘊含豐富的內生菌資源和活性物質。葡萄果皮、果梗中的酚類物質，尤其是色素類物質通過發酵轉移到葡萄酒中，再經過陳釀相互轉化、合成，影響葡萄酒顏色的變化，而其中的內生菌隨著發酵進入葡萄酒，影響葡萄酒中與顏色有關的物質的變化。一方面可以提高寄主抗逆性，提供有益的活性化合物，另一方面威脅了食品安全，具有雙重作用。

基于以上研究分析，內生菌對葡萄酒的顏色有非常重要的影響，具有廣泛的研究價值，非常有必要開展關于葡萄酒中內生菌的篩選、鑒定、多樣性及對葡萄酒顏色影響機理的研究。

3 展望

葡萄酒作為一種世界性的特殊飲料食品，其品質的優劣影響到消費者的喜好，其安全性影響到消費者的身心健康和葡萄酒的推廣。顏色作為葡萄酒品質的一個重要參考指標，不但影響到消費者的感官評定，而且其酚類成分自聚或與其它物質結合發生轉化，影響葡萄酒的品質。只有顏色穩定的葡萄酒才是安全的，其品質才能得到保障。目前對于葡萄酒顏色的科學研究主要集中在利用內生菌調節葡萄在生長期間色素類物質的變化，采取各種措施獲得澄清的葡萄酒，提高和穩定葡萄酒中的色素類及與色素類物質變化有關的酚類、香氣物質、pH值和酒度等成分含量方面，及控制酵母菌、細菌、乳酸菌和醋酸菌等內生菌群體數量（這方面研究絕大多數集中在篩選和鑒定上，進一步的研究非常缺乏），這些成分和內生菌往往具有雙重作用，并且也沒有更詳細的理論研究。除此之外，聚合、分解、化合或轉化等作用導致了葡萄酒各成分之間的不平衡——直觀地體現在葡萄酒的顏色、香氣和口感之間的不平衡。大量事實證明，內生菌使生物轉化復雜化，是聚合、分解、化合或轉化等作用的推動力，這加劇了葡萄酒顏色的變化。我國各葡萄酒產區生態特點獨特，內生菌菌群復雜多樣，引起了葡萄酒顏色豐富多變的同時，也引起了葡萄酒其它風味成分的變化。因此，顏色的變化會帶動葡萄酒整體結構和成分的改變。基于此，需要借助科學手段探索引起葡萄酒顏色變化的根源及其機制，有助于我們因地制宜地采取科學措施穩定葡萄酒顏色，保障葡萄酒的品質與安全。因此，對于葡萄酒顏色變化的研究具有顯著的科學和實踐意義，對其質量與安全的評價是未來科學發展的必然趨勢。

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