微生物單寧酶及其生物技術進展

錢高青，杜冰心，汪竹群，丁艷日，欒少華，柯春林

（蚌埠學院食品與生物工程學院，安徽蚌埠 233030）

單寧是一種來源于植物的多酚化合物，分子量為500～3 000 kDa。盡管單寧具有抗菌活性，但許多微生物對單寧具有一定的抗性，并能在其上生長和發育，微生物通過分泌單寧酶來解除單寧的抑制作用。單寧酶即單寧酰基水解酶，它能夠水解單寧酸的酯鍵產生葡萄糖和沒食子酸酯[1]。單寧酶作為誘導酶是由微生物（如細菌、真菌和酵母） 產生的。真菌（如曲霉、青霉）、細菌（如芽孢桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、乳酸菌、片球菌） 產生的單寧酶能降解鞣花單寧產生的葡萄糖和沒食子酸，然后進入檸檬酸循環。單寧酶在食品和藥品工業中有廣泛應用，如單寧酶用于啤酒和果汁的澄清[2]，單寧酶處理的綠茶具有較高的抗氧化性能，它能抑制綠茶和紅茶中的致癌物質亞硝胺[3]。綜述了單寧酶的微生物來源、發酵條件、純化方法和酶生物技術進展。

1 單寧細菌降解

據報道產酶菌株，如芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和克雷伯氏桿菌等以單寧酸為唯一碳源[4]。產單寧酶，依賴單寧生存的細菌屬于抗單寧微生物，這種抗性不受自身種類和地域的限制。細菌如無色桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草桿菌、棒狀桿菌和鏈球菌也能有效生產單寧酶。人們已經從人類糞便和植物性發酵食品中分離出產單寧酶乳酸桿菌[5]。存在于食品和腸道中的乳酸菌可以水解單寧，并降低細胞對單寧的吸附能力。此外，許多經常食用的食品飲料和茶葉中含有具有不同藥理活性的水解單寧，而且人體消化道存在單寧酶活性的乳酸桿菌能顯著影響這些單寧酸的性能。細菌單寧酶大多以沒食子酸甲酯為底物，然后產生最終的氧化產物沒食子酸。植物乳桿菌通過降解橄欖油廠廢水中的高分子量酚類化合物并降低低分子量酚類化合物的產生，從而把單寧酸降解成為單體物質[6]。細菌能夠分解一些酚類化合物，如天然的原花青素和原兒茶酸。據報道無色桿菌屬中的好氧細菌能夠降解沒食子鞣質，多黏芽孢桿菌、棒狀桿菌和肺炎克雷伯菌能夠對質量分數為1%的沒食子鞣質進行降解[7]。此外，短小芽孢桿菌、多黏芽胞桿菌和植生拉烏爾菌能夠以栗樹皮作為碳源底物產生單寧酶，進而降解單寧并釋放出沒食子酸。但是，短小芽孢桿菌卻產生諸如2,3-沒食子酸結構的2種中間產物，它們大多數都連有葡萄糖殘基。據報道大腸桿菌和棕色固氮菌對單寧有同樣的利用率，也即0.65%（W/V）。從制革廢水分離出的弗氏枸櫞酸桿菌能在高濃度單寧5%（W/V） 的基本培養基中生長[8]。到目前為止，盡管單寧的具體代謝途徑還不是很清楚，但是細菌可以通過對單寧的改性、降解、失活和金屬離子螯合等途徑來消除單寧的抑制作用。

2 單寧真菌降解

與縮合單寧（荊樹單寧） 相比，青霉、曲霉、木蹄、豬苓、栓菌在水解鞣質（鞣酸）中生長良好。大多數的制革廢水降解真菌為青霉和曲霉。除了這些，從人參、毛發、皮膚中分離的真菌包括毛殼霉、鐮刀菌、立枯絲核菌也具有降解制革廢水污染物的能力[9]。在這個降解過程中，中間體（如順烏頭酸、α-酮戊二酸和檸檬酸）也被釋放。除了兒茶素，煙曲霉在6～8 d內能把單寧分解為沒食子酸。有研究表明，青霉類和曲霉利用兒茶素、沒食子和沒食子酸為碳源產生單寧酶[10]。在各種真菌系統中，單寧的降解被認為是迅速存在的碳源補充劑。國外學者已經對產黃青霉分解單寧酸和沒食子酸的生長動力學如溫度、pH值和碳源進行了研究。真菌，如煙曲霉菌、黑色消化球菌和海綿共生真菌能夠降解單寧為草酸[11]。黑曲霉、黃曲霉和米曲霉產胞外酶，并以單寧酸作為有效的（氮）碳源。很明顯，以上的研究證明，單寧酶是一種誘導酶。在現有的微生物酶中，曲霉屬真菌產生的酶是最有潛力和商業生產前景的。有些真菌（如曲霉、青霉）通過單寧降解系統抵抗高濃度單寧[11]。有研究顯示，微生物固態發酵（SSF）產生的單寧酶活性要比深層發酵（SMF）產生的酶活性的效價高[12]。盡管在SSF中不同的生理原因尚不完全清楚，但是有許多關于SSF產酶行為差異的幾種理論，合理的解釋是由于底物濃度梯度的形成和及時去除產物的作用，從而影響酶生產。

3 單寧酶及其性質

為了利用不同類型的底物，由于協同作用，自然環境中的微生物需要分泌酶、碳水化合物和酯類化合物的結合物。只要培養基含有少許酚類化合物底物，微生物就能生產胞內和胞外酶復合物。結果這種生物酶的抑制作用減少了微生物的生長，并延緩有機質的分解。隨著2，3，4，6四沒食子酰葡萄糖和2個其他類型的單沒食子酰基葡萄糖的出現，單寧酸完全水解為沒食子酸和葡萄糖[13]。除了單寧酸外，單寧酶能加強甲基沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、沒食子酸丙酯和沒食子酸沒食子酸酯的裂解。對不同的單寧底物，所有微生物來源的單寧酶的活性是有差異的。來自真菌和酵母的單寧能較好地降解水解單寧，但不能分解天然的鞣質單寧[7]。細菌單寧酶的性質是多變的，這種差異取決于產單寧酶的微生物本身。細菌單寧酶的分子量為46.5～90 kDa。來自黑曲霉的單寧酶是一種糖蛋白，分子量約為186 kDa。通過麥麩固態發酵，已經分離到黑曲霉ATCC 16620胞外酶，但是該酶需要進一步純化才能弄清其結構、功能關系和生化特性[14]。

4 產單寧酶發酵條件

采用多種不同發酵方式，微生物單寧酶的產量可以得到提高。例如，通過黑曲霉的表層培養[15]和米根酶的固態發酵，其產酶量都能得到提高[16]。在30℃和pH值6.6條件下，在查氏基本培養基中添加2%的單寧酸和0.2%的葡萄糖，酶的產量可提高1.13倍。塔拉黑曲霉產單寧酶的最適溫度是60℃，但LCF8黑曲霉產酶的最適溫度是35℃[17]。米曲霉、曲霉屬、桔青霉產單寧酶的最適溫度范圍為30～40℃[18]。從植物乳桿菌CECT 748 T中分離的單寧酶的最適溫度為30℃，而且在50℃仍然具有75%的酶活。有報道說，鉀離子能提高黑曲霉產酶活性，鈣離子和鋅離子抑制能抑制其產酶活性[19]。植物乳桿菌CECT 748在30℃時酶活性最高，為6.26 U/mL[20]。產單寧酶的菌株（如米曲霉、黃青霉和黑曲霉產酶） 的最佳溫度為30～40℃，pH值為5[21]。深層發酵中，溫度為30～33℃，初始pH值為3.5～6.5，黑曲霉屬產單寧酶的產量能夠得到提高[15]。

5 單寧酶純化

單寧酶純化取決于市場、加工成本、最終的質量和可用的技術。大規模、成本有效的蛋白純化方面的需要導致技術變革，要求在較少的處理步驟中能提供快速、高效和經濟的手段。商用單寧酶一般需要純化，但在廢物處理行業中應用單寧酶的純度要求并不高[22]。單寧酶純化后，其催化性能和穩定性都得到提高，而且能防止不必要反應的發生。目前，已有關于微生物來源單寧酶的純化以及酶特性分析的報道。純化不僅僅是一個特有的方法，它也是一項綜合的技術，純化后黑曲霉產單寧酶的產量可從2.9%增加到50%[23]。這在各種食品、飼料、皮革、釀酒、制藥行業的應用，以及親和層析技術中也有相關的報道。通過超濾、高效液相色譜、電泳等純化技術可得到高純度的酶[24]。然而，這些處理過程費用高，同時產量也很低。而且因此這些方法獲得的純化酶丟失了部分活性，不適合生化研究。純化中，酶的純度固然重要，但費用低而且快速的純化過程也是必要的。文獻報道酶的純化步驟包括一系列過程，即蛋白沉淀和隨后的離子交換或凝膠過濾色譜層析[25]。細胞外單寧酶的純化可以通過2種色譜法，即G-150葡聚糖凝膠層析柱層析和DEAE-纖維素離子交換色譜層析，據報道葡聚糖凝膠柱凝膠150能分離出單寧酶的2種異構體（TAH I，TAH II）。

6 單寧酶的克隆和表達

重組DNA技術為轉基因微生物的生產酶提供了新機遇。由于使用傳統技術生產單寧酶遇到了難題，因此分子生物學技術被用于單寧酶的生產中，采用重組微生物技術可提高酶產量。有研究通過對單寧酶基因CECT 748 T進行克隆，利用pUR13載體表達，然后進行酶的純化。在T7 RNA聚合酶誘導調控下，該酶基因的功能也被確定并在大腸桿菌中得到表達。由于克隆重組植物乳桿菌單寧酶蛋白質具有6個親和性高的組氨酸序列，通過反義引物在DNA聚合酶作用下擴增，植物乳桿菌SN35N單寧酶編碼基因被克隆到質粒pGEM-T上，然后在大腸桿菌BL21中得到表達。據報道，有研究者已經開發出與結腸癌有關的產單寧酶細菌，而且能鑒別了該產單寧酶細菌基因。據報道，來自蘆柑的pT Ztan18核苷酸序列（AB244239） 為6 994 bp，假設每個ORF能夠編碼多肽，它有3個開放閱讀框（ORF）。ORF1，ORF2和ORF3分別編碼635，643和613個氨基酸殘基。其中，在添加酵母提取物的腦心浸液中，ORF3具有一個很明確的功能區域，它被命名為Tan A。由于蘆柑Tan A的獨特性，它已被用于Southern印跡雜交和PCR技術中。因此，Tan A被用作快速檢測蘆柑的生物標記基因。在現有的細菌、真菌和酵母菌種，單寧酶的核苷酸和氨基酸序列表現出相似性。此外，腸細菌和單寧酶可用于保護放牧的草食動物和環境免受單寧的毒性作用。腸桿菌屬單寧酶約1 410 bp組成，編碼469個多肽氨基酸殘基。據報道，人們已經從葡萄球菌、植物乳桿菌中克隆出單寧酶基因。

7 來自宏基因組文庫的單寧酶

然而，這些方法主要限于可培養的微生物，對于那些具有產單寧酶潛力的不可培養微生物并不一定適用。研究人員現在正在采用宏基因組學的方法鑒定并開發不可培養微生物的單寧酶基因。到目前為止，傳統的技術僅僅注重可培養微生物的單寧酶基因，通過宏基因組學文庫分離單寧酶基因可克服此缺點。因為在沒有微生物實驗室培養的條件下，宏基因組學的方法可以尋求工業應用上需要的新的功能酶。據報道，宏基因組技術分離的單寧酶Tan 410能夠固定各種支持物，如石英SBA-15、殼聚糖、海藻酸鈣和離子交換樹脂IRC50。同常規的單寧酶相比，這些酶的耐熱能力可提高500～1 000倍。此外，在包埋一個月的最佳反應條件下，它仍然可以保持95%的初始酶活性。目前，已經從棉花樣品中宏基因組文庫分離出獨特的單寧酶基因Tan 410。通過SDS-PAGE和凝膠過濾層析的序列分析，該酶由521氨基酸殘基組成，是分子量為55 kDa的單體酶。該酶在pH值為6.4，溫度為30℃條件下能活化。通過序列對比分析，單寧酶Tan 410基因編碼一個全長為1 536 bp的ORF，其具有很好的耐鹽性，在4 mol/L氯化鈉條件下很穩定，在5 mol/L氯化鈉環境中仍然能保留80%的活性。另外，來自蠟樣芽胞桿菌的與Tan 410特性類似的單寧酶可用來作為制革廠污水理想的凈化劑。除了單寧酸外，HPLC分析表明在40 min內，Tan 410具有水解不同底物的能力，如表兒茶素、沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、阿魏酸乙酯、迷迭香酸和綠原酸。

雖然單寧酶在飲料、食品、飼料以及制革廢水凈化方面有一定應用，但工業生產單寧酶的成本高。因此，單寧酶基礎和應用方面的研究更值得關注，如酶的調控、新的表達系統、利用大規模培養技術設計新的生物過程、高效經濟的下游加工技術、單寧酶應用的新設計。此外，應該通過宏基因組學方法和蛋白質工程開發新型單寧酶。這樣可能尋找到具有獨特性能的、適用于各種工業應用的單寧酶。