人臍帶源間充質干細胞對心力衰竭患者PBMC增殖能力的影響

張晶晶 石亞楠

心力衰竭(heart failure, HF)是各種心臟疾病的終末階段, 目前仍有較高的致死率。既往多項研究發現間充質干細胞(MSCs)在體外能夠刺激活化的人的PBMC、鼠的脾臟細胞和分離純化的CD4+ T細胞產生CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞［1］。陶恩學［2］認為人類MSCs可以通過上調通CD4+CD25+Treg細胞而改變患者的免疫系統從而改善心功能。所以本研究通過觀察hUC-MSCs對HF患者PBMC增殖能力的影響,探討hUC-MSCs對HF的免疫調節作用, 為hUC-MSCs治療HF提供新的免疫學理論依據。現報告如下。

1　材料與方法

1.1材料 臍帶來源：經產婦同意后按照醫院規定取自河南省人民醫院產科足月健康剖宮產產婦。人外周血來源：經患者同意后按醫院規定取自河南省人民醫院心血管內科二住院9例HF患者。入選標準：①確診為HF≥3個月, HF診斷標準參考《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》；②美國紐約心臟病學會(NYHA)分級為Ⅱ～Ⅳ級；③射血分數＜40%。

1.2方法與步驟

1.2.1人臍帶源MSCs的分離、培養及鑒定 無菌條件下取臍帶標本, 分離出華通氏膠組織后用PBS反復沖洗后剪成大小約1 mm3小碎塊, 置于T25培養瓶中培養, 培養至第3代后將細胞消化離心成濃度為≥1×106/ml單細胞懸液, 流式細胞儀檢測hUC-MSCs特異性表面抗原。

1.2.2hUC-MSCs生長曲線測定 取第3代hUC-MSCs制成濃度為1×104/ml細胞懸液, 向各孔中加入MTT重新置于培養箱中培養4 h, 后吸去MTT, 在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔細胞的吸光度值A, 連續檢測9 d后以天數為橫坐標,細胞的吸光度值A為縱坐標, 繪制出hUC-MSCs生長曲線。

1.2.3hUC-MSCs對PHA作用下HF患者PBMC增殖能力的影響

1.2.3.1實驗分組 A組：PBMC+PHA；B組：PBMC+PHA+2×105個/ml hUC-MSCs；C組：PBMC+PHA+2×104個/ml hUC-MSCs；D 組：PBMC+PHA+2×103個/ml hUC-MSCs；E組：2×105個 /ml hUC-MSCs；F組：2×104個/ml hUC-MSCs；G組：2×103個 /ml hUC-MSCs。

1.2.3.2實驗過程 第3代hUC-MSCs培養箱內培養24 h,PBMC(密度梯度離心法分離出HF患者PBMC)以2×105個/ml接種于絲裂霉素C處理的hUC-MSCs上, 加入PHA以刺激PBMC增殖, 培養72 h后, 加入MTT繼續孵育4 h, 在酶聯免疫檢測儀上于570 nm處測量各孔細胞的吸光度值A, 計算增殖抑制率。增殖抑制率=［對照空白PBMC的A值-(實驗孔A值-相同hUC-MSCs濃度空白對照孔A值)］/對照空白PBMC的A值×100%。

1.2.4hUC-MSCs培養上清對PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影響

1.2.4.1實驗分組 A組：RPMI1640完全培養基(含10%FBS)培養組；B組：hUC-MSCs培養上清+RPMI1640完全培養基培養組(1：1)；C 組：hUC-MSCs培養上清 (含10%FBS)培養組。

1.2.4.2實驗過程 ①條件培養基配制：將1.5×106個第3代hUC-MSCs細胞接種于T75培養瓶中, 加入15 ml含10%FBS的低糖DMEM完全培養基, 待細胞達80%～90%融合時收集細胞培養上清液。②hUC-MSCs培養上清對PHA作用下的HF患者PBMC增殖能力的影響：按實驗分組重懸PBMC, 加入PHA以刺激PBMC增殖培養72 h后, 每孔加入MTT繼續孵育4 h, 在酶聯免疫檢測儀上于570 nm處測量各孔細胞的吸光度值A, 計算增殖抑制率。增殖抑制率=(對照正常培養基培養PBMC的A值-條件培養基培養PBMC的A值)/對照正常培養PBMC的A值×100%。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0統計學軟件對研究數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差表示, 多組間比較采用單因素方差分析, 兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1hUC-MSCs免疫表型鑒定 流式鑒定結果顯示CD29、CD44為陽性, CD34、CD45為陰性。

2.2hUC-MSCs生長曲線 MTT檢測法的結果顯示第3代hUC-MSCs生長情況基本為：第1～2天細胞處于潛伏期。第3～6天開始細胞進入對數生長期, 呈明顯的增殖狀況, 且生長迅速。第6～7天后細胞進入平臺期。

2.3hUC-MSCs對PHA激活的HF患者PBMC增殖能力的影響 多功能酶標儀檢測hUC-MSCs對PHA作用下PBMC增殖抑制的結果顯示hUC-MSCs對PHA作用下PBMC增殖呈抑制作用, 且此作用呈劑量依賴性, B組、C組、D組增殖抑制率分別為(74.92±1.17)%、(51.56±4.36)%、(25.24±2.24)%, 比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。

2.4hUC-MSCs培養上清對PHA激活的HF患者PBMC增殖的影響 多功能酶標儀檢測hUC-MSCs條件培養上清對PHA作用下PBMC增殖抑制作用呈劑量依賴性, B組、C組增殖抑制率分別為(25.82±2.26)%、(39.52±4.12)%, 比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。

3　討論

目前許多研究顯示, MSCs移植可緩解HF患者臨床癥狀, 改善其心功能［3-6］。本實驗中選取hUC-MSCs進行實驗, 首先研究了hUC-MSCs對于HF患者PBMC增殖能力的影響, 本實驗中首先采取直接接觸法培養細胞, 發現hUCMSCs可呈劑量依賴性抑制PHA激活的HF患者PBMC增殖, 當hUC-MSCs與PBMC以1：1相互作用時, 抑制率高達(74.92±1.17)%, 提示細胞與細胞間直接接觸在hUC-MSCs對于HF患者的免疫抑制過程中發揮至關重要的作用, 隨后采用“未激活”的hUC-MSCs條件培養基培養PHA刺激下的HF患者的PBMC, 發現條件培養基能夠抑制PBMC的增殖, 抑制率為(39.52±4.12)%, 雖然其抑制增殖能力較MSCs-PBMC直接接觸途徑差, 但仍說明hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力抑制HF患者PBMC增殖反應, 這與陶恩學［2］的研究是一致的, 具體可能是通過上調CD4+CD25 Treg細胞。有研究表明慢性HF患者存在免疫調節功能受損, 正是通過測定CD4+CD25 Treg細胞水平得出的結論［3］。

綜上所述, hUC-MSCs呈劑量依賴性抑制PHA刺激下HF患者PBMC增殖, hUC-MSCs條件培養基同樣可抑制此過程, 但抑制程度較輕, 仍提示hUC-MSCs具有固有免疫分泌能力參與此抑制過程, 為hUC-MSCs對HF患者的免疫治療提供了新的理論依據。

［1］ 何偉剛.CD4+CD25+調節性T細胞與負向免疫調控及免疫耐受.國際腫瘤學雜志, 2006, 33(5)：324-328.

［2］ 陶恩學.骨髓間充質干細胞對鼠心力衰竭CD4+ CD25+ Treg細胞的影響.濰坊醫學院學報, 2014(5)：334-336.

［3］ 胡澤平, 王邦寧, 李嘉嘉.慢性心力衰竭患者外周血CD4+CD25+ CD127-調節性T細胞和自然殺傷細胞的變化.安徽醫科大學學報 , 2010, 45(1)：98-101.

［4］ 張玉琳, 王靜文, 于紀棉.人臍帶和骨髓源間充質干細胞對臍血單個核細胞增殖能力的影響.檢驗醫學與臨床, 2014(4)：433-435.

［5］ 陳璇.人臍帶間充質干細胞培養上清的免疫抑制作用研究.廣東藥學院, 2014.

［6］ 田甜.人臍帶源間充質干細胞對心力衰竭患者CD4+CD25+CD127low調節性T細胞的影響.鄭州大學, 2016.