青稞新光合作用相關基因的克隆和序列分析

巴桑玉珍，扎 桑，王玉林，徐齊君，原紅軍，尼瑪扎西

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850002；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩850002；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院，西藏拉薩850002）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）屬禾本科大麥屬，是栽培大麥的變種，成熟時籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，也稱裸大麥。青稞是高原特色農(nóng)作物之一，有獨特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用，具有顯著的利用價值，為藏族人民主要糧食作物，其產(chǎn)量高低直接關系到藏區(qū)人民的經(jīng)濟和生活[1]。青稞主要生長在海拔高、溫度低、降水量少、蒸發(fā)量大、日照長、晝夜溫差大的地區(qū)，對環(huán)境的抗逆性較強。因此，探究青稞的抗逆機制和光合機制對于選育適應性強、產(chǎn)量高、綜合性狀優(yōu)良的青稞品種具有重要的意義。

長期以來，人們試圖通過各種手段來提高作物產(chǎn)量，其中提高作物光合速率是提高產(chǎn)量的重要手段，因此，光合機理的研究近年來日益受到研究者的重視[2]。在植物光合作用中，卡爾文循環(huán)（Calvin cycle）在CO2的同化過程中發(fā)揮著重要作用，其相關酶活性的變化直接影響光合產(chǎn)物的積累。核糖-5-磷酸異構(gòu)酶（ribose-5-phosphate isomerase，RPIA）、核酮糖-磷酸3-異構(gòu)酶（ribulose-phosphate 3-epimerase，RPE）、 蘋 果 酸 脫 氫 酶 （malate dehydrogenase，MDH） 和果糖 -1,6-二磷酸激酶（fructose-1,6-bisphosphatase，F(xiàn)BP）等均參與了該過程。RPIA是自然界中廣泛存在的一種高度保守的蛋白酶，參與原核生物和真核生物的糖代謝（如磷酸戊糖途徑），同時在卡爾文循環(huán)中必不可少，其能夠促使R5P（ribose-5-phosphate）和 Ru5P（ribulose-5-phosphate）進行相互轉(zhuǎn)化[3-4]；RPE在卡爾文循環(huán)和磷酸戊糖途徑中均發(fā)揮著重要作用，其與核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相關[5-6]；MDH 在卡爾文循環(huán)中負責將NAD+轉(zhuǎn)化成NADH，提供還原力[7]；FBP在卡爾文循環(huán)中負責將果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化成果糖 -6- 磷酸[8]。目前，在水稻[9-10]、玉米[11-13]、油菜[14]、番茄[15-17]、擬南芥[18-20]等植物中大量的光合相關基因已經(jīng)得到了克隆，而在青稞中還未見報道。因此，我們以青稞品種甘農(nóng)大7號為材料，進行4個光合作用相關酶編碼基因的克隆并做了生物信息學分析，旨在為進一步研究青稞的光合作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞品種甘農(nóng)大7號由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所和青海省農(nóng)林科學院提供，該品種通過嚴格的育種選擇程序而得到，籽粒飽滿，抗白粉病，不耐貧瘠。

1.2 方法

1.2.1 青稞種苗總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。取適量的青稞種子播種于富含有機質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長至2～3片葉時，采用Analytikiena公司的Jena InnuPREP RNA Mini Kit提取新鮮葉片RNA，采用Qiagen公司的TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit進行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本于-20℃保存。

1.2.2 4個光合作用相關基因的克隆。以前期不同時期干旱復水誘導轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果為基礎，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計02833、03360、45441和45453這4個光合作用相關基因的特異引物（表1）。

表1 引物列表

RT-PCR反應在S-1000 Thermal Cycler進行，反應體系采用20 μL PCR擴增體積：TaqDNA聚合酶 (TaKaRa，5 U/μL)0.2 μL，10×PCR 反應緩沖液(Takara)2 μL，dNTP(10 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌水 12.6 μL。反應條件：94℃變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。分別回收目標片段，克隆于pMD18-T載體上，挑陽性菌測序。

1.2.3 4個基因的生物信息學分析。根據(jù)測序得到的02833、03360、45441和 45453基因序列，推測其編碼序列（coding sequences,CDS）和氨基酸序列，利用NCBI（http://ncbi.nlm.nih.gov/）、ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）、Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal IP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、PredictProtein（https://ppopen.rostlab.org/）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）等網(wǎng)絡資源對02833、03360、45441和45453基因進行序列分析。

圖1 02833、03360、45441和45453基因擴增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 02833、03360、45441和45453基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列為基礎設計特異引物，擴增甘農(nóng)大7號青稞苗期葉片的cDNA，分別特異性獲得513、822、1 023和579 bp的4條cDNA序列（圖1），測序分析顯示這4條片段序列如圖2所示，與預期的基因序列基本一致，表明02833、03360、45441和45453基因擴增成功。

2.2 02833、03360、45441和45453基因的生物信息學分析

根據(jù)獲得的 02833、03360、45441 和 45453 基因序列信息，在NCBI網(wǎng)站進行Blastn比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)02833可能編碼一個核糖-5-磷酸異構(gòu)酶3，其與山羊草、小麥、二穗短柄草、水稻等核酸序列的相似性分別為92%、88%、86%和85%，NCBI上登陸的02833基因CDS全長為831 bp，編碼270個氨基酸，本研究中所得為02833基因的CDS部分片段。

03360可能編碼一個核酮糖-磷酸3-異構(gòu)酶，其與山羊草、小麥、二穗短柄草、水稻等相應核酸序列的相似性分別為96%、96%、93%和88%，根據(jù)NCBI在線軟件ORFfinder，推測青稞03360的CDS全長為822 bp，進一步以得到的CDS推測氨基酸序列，預測03360基因編碼一個273個氨基酸的多肽，分子量為 29.6 kDa，等電點（pI）為 8.61（圖 3）；將該氨基酸序列進行Blastp比對后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列屬于ICL_KPHMT superfamily家族之一，含有典型的ICL_KPHMT superfamily結(jié)構(gòu)域（圖4）；通過TargetP對03360蛋白的轉(zhuǎn)運肽進行分析和預測，發(fā)現(xiàn)其不存在轉(zhuǎn)運肽，為胞漿蛋白，利用TMHMM Server V2.0在線軟件對03360蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不存在跨膜區(qū)（圖5）。

圖 2 02833(a)、03360(b)、45441(c)和 45453(d)基因片段測序結(jié)果

圖3 03360基因CDS及其編碼氨基酸的全長序列

圖4 03360基因Blastp對比圖

圖5 03360跨膜結(jié)構(gòu)域預測分析

圖6 45441基因CDS及其編碼氨基酸的全長序列

45441基因編碼一個340個氨基酸的多肽，預測分子量為36 kDa，等電點（pI）為 8.24，這個多肽可能是一個蘋果酸脫氫酶，其與山羊草、二穗短柄草、水稻和玉米等核酸序列的相似性分別為96%、92%、88%和87%，根據(jù)NCBI在線軟件ORF finder，推測青稞45441的CDS全長為1 023 bp，進一步以得到的CDS推測氨基酸序列（圖6），將該氨基酸序列進行Blastp比對后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列屬于Ldh_1_C superfamily家族之一，含有典型的Ldh_1_C superfamily結(jié)構(gòu)域（圖 7）；通過 TargetP對45441蛋白的轉(zhuǎn)運肽進行分析和預測，發(fā)現(xiàn)其不存在轉(zhuǎn)運肽，為胞漿蛋白。利用TMHMM Server V2.0在線軟件對45441蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不存在跨膜區(qū)(圖8)。

45453基因可能編碼一個果糖-1,6-二磷酸激酶，其與山羊草序列的相似性為95%。

圖7 45441基因Blastp對比圖

圖8 45441跨膜結(jié)構(gòu)域預測分析

3 結(jié)論與討論

中國具極端條件的耕地面積遼闊，地形復雜，培育適于各種極端環(huán)境條件且高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物是研究者持之以恒的目標。青稞可以在青藏高原高海拔、高寒的極端條件下生長，對環(huán)境有較強的適應性；同時青稞自身具有一定的保健功能。因此，青稞這一特殊種質(zhì)資源具有很大的利用價值，研究其光合機制對于選育適應極端環(huán)境條件的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物具有重要意義。RPIA、RPE、MDH和FBP是光合作用過程中參與卡爾文循環(huán)的4個重要的酶，其活性的變化直接影響卡爾文循環(huán)的進行，最終對光合產(chǎn)物的合成產(chǎn)生影響。Mantin等從菠菜葉綠體中克隆得到了一個RPIA基因，該基因與卡爾文循環(huán)及氧化戊糖磷酸途徑相關，推測其編碼239個氨基酸[3]；Paul等發(fā)現(xiàn)擬南芥RPIA基因RSW10與纖維素合成相關，其突變體中纖維素合成受阻[21]；此外，Schreier等研究發(fā)現(xiàn)RPIA還與植物防衛(wèi)反應相關[22]。這說明，RPIA的功能存在多樣性，不僅僅局限于光合作用中。針對RPE的研究發(fā)現(xiàn)，RPE在卡爾文循環(huán)和磷酸戊糖途徑中均發(fā)揮著重要作用，其與核酮糖-1,5-二磷酸（ribulose 1,5-bisphosphate）的再生相關[5-6]。Tesfaye等研究發(fā)現(xiàn)，在苜蓿中過表達MDH能夠提高轉(zhuǎn)基因植株中有機酸的合成，增強植株對鋁離子和酸性土壤的適應性[23]，而Nunes-nesi等發(fā)現(xiàn)在番茄中反義表達線粒體MDH基因能夠增強植株的光合性能[24]。此外，研究表明，MDH在卡爾文循環(huán)中負責將NAD+轉(zhuǎn)化成NADH，提供還原力[7]，這說明MDH的功能同樣存在多樣性，可能與植物光合作用和抵抗逆境密切相關。對FBP的研究發(fā)現(xiàn)，其在卡爾文循環(huán)中負責將果糖-1,6-二磷酸轉(zhuǎn)化成果糖-6-磷酸[8]。綜上，RPIA、RPE、MDH和FBP等除了與光合作用相關外，還可能與植物抵抗逆境相關，進一步研究青稞中這些基因的功能，不僅能夠揭示青稞的光合機制，也有可能提供青稞適應極端條件的分子依據(jù)。本研究中克隆得到的 02833、03360、45441和 45453基因分別對應于這4個酶的編碼序列，這些基因的分離和鑒定為下一步的研究奠定了基礎。

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