柴胡皂苷d-黃芩苷配伍對CCl4誘導大鼠HSC 的TLR4-NF-κB通路作用研究*

李 敏，高 凱，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

陜西中醫藥大學藥學院(咸陽 712046)

肝纖維化是各種急慢性肝病常見的病理改變，其病理機制是肝臟中HSC持續激活轉換成為肌成纖維樣細胞，增殖合成細胞外基質(Extracellular matrixc,ECM)并過度沉積產生肝纖維化[1]。課題組研究表明，柴胡、黃芩配伍水煎液對大鼠肝纖維化模型及CCl4損傷L02細胞有良好的改善作用[2]，作用機制與TLR4-NF-κB信號通路有一定關聯[3]。本研究探討柴胡、黃芩中有效成分柴胡皂苷d-黃芩苷對CCl4誘導的HSC作用，進一步從TLR4-NF-κB信號通路的角度闡釋其抗肝纖維可能的作用機制。

材料與方法

1 試劑與儀器 大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)，購自灝洋生物公司；1640培養基、TLR4、NF-κB一抗、二抗購自博士德生物科技公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；胰酶，購自Trypsin。TAK-242購自Invivo Gen 公司，BYA 11-7082購自江蘇碧云天生物科技公司；HA、LN、PCIII、IV-C試劑盒購自北京永輝生物科技有限公司。

CO2培養箱、雙人型超凈工作臺(新加坡ESCO)；倒置顯微鏡(奧特BDS200)；酶標儀(美國BioTek ELx808)；離心機(湘儀L530)。

2 實驗藥品

2.1 柴胡皂苷d、黃芩皂苷購自陜西中鑫生物技術有限公司，參考文獻[5-6]及預實驗結果，柴胡皂苷d和黃芩皂苷以1∶2.5的比例溶于DMSO中，以下簡稱SB。

2.2 CCl4溶液的制備:CCl4與DMSO各100 ml混勻，無血清培養基稀釋至6 mmol/L。

3 HSC-T6培養及藥物處理 HSC-T6于1640培養基，37℃、5% CO2培養箱培養傳代。至對數生長期時，在無血清培養基中培養24 h后，1.5×106個/ml濃度接種過夜。實驗分空白對照組( 無藥物處理) ，CCl4誘導組(6mmol/L CCl4作用 6 h)，給藥組(6mmol/L CCl4作用 6 h后，再用2.5、5、10 μg/ml的SB作用24 h)，TAK-242、BYA 11-7082組(6mmol/LCCL4作用 6 h后，再用TAK-242 10 mol/L、BYA 11-7082 2 mol/L作用24 h)。

4 SB對CCl4誘導的HSC細胞增殖的影響 MTT法檢測大鼠HSC增殖抑制率。細胞抑制率=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。

5 SB對CCl4誘導的HSC分泌HA、LN、PCIII、HA的影響 培養24 h后，收集細胞培養液，參照試劑盒使用說明書，應用Elisa法檢測HA、LN、PCIII、HA含量。

6 SB對CCl4誘導的HSC的TLR4和NF-κBp65的mRNA水平的影響 培養24 h后，收集細胞，抽提細胞總RNA，通過RT-PCR的方法，檢測的TLR4和NF-κBp65mRNA表達，PCR使用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

7 SB對CCl4誘導的HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表達的影響 培養24h后，胰酶消化收集，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑裂解，離心，取上清，蛋白定量，細胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性。用 10% SBS-PAGE 分離蛋白，轉膜后5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h，一抗4 ℃ 過夜，二抗室溫 2 h，洗膜后，加ECL 發光液，曝光。TLR4和NF-κBp65蛋白表達水平用目的條帶積分吸光度值(Integrated absorbance，IA) 與內參GAPDH蛋白條帶的 IA 比值定量表示。

結 果

1 SB對CCl4誘導的HSC增殖的影響 與空白對照組比較，CCl4干預后，顯著促進HSC細胞增殖(P<0.01)，SB對HSC細胞增殖具有顯著抑制作用，劑量為10 μg/ml時，作用最明顯；TAK-242 和BYA-11 7082也對HSC細胞增殖具有顯著抑制作用。結果見表2。

表2 對CCl4誘導的HSC 增殖的影響

注：與CCl4干預組比較，**P<0.01，*P<0.05

2 SB對CCl4誘導的HSC分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影響 與空白對照組比較，CCl4干預后，細胞培養液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明顯升高，SB、TAK-242 和BYA-11 7082對HA、LN、PCIII、IV-C分泌具有顯著抑制作用。結果見表3。

表3 SB對經CCl4誘導的HSC-T6分泌HA、LN、PCIII、IV-C的影響

注：與CCl4干預組比較，**P<0.01，*P<0.05

3 RT-PCR檢測HSC中TLR4和NF-κBp65 mRNA表達 與空白對照組比較，CCl4干預后，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達增強，SB、TAK-242 和BYA-11 7082則對TLR4和NF-κBp65 mRNA表達有下調作用，其中SB 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表4。

表4 SB對CCl4干預后HSC的TLR4NF-κB基因表達的影響

注：與CCl4組比較，*P<0.05

4 Western Blot法檢測HSC中TLR4和NF-κBp65蛋白表達 與空白對照組比較，CCl4干預后，TLR4和NF-κBp65蛋白表達增強，SB、TAK-242 和BYA-11 7082對 HSC細胞TLR4和NF-κBp65 蛋白表達有下調作用，其中SSB- 10 μg/ml、TAK-242 和BYA-11 7082組差異有統計學意義(P<0.05)，結果見表5。

表5 CQ對CCl4干預后HSC的TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

注：與CCl4組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

HSC在多種因素刺激后轉換成為肌成纖維樣細胞，大量增殖合成ECM，在肝內過量沉積導致肝纖維化。研究發現，TLR4激活后可調控下游NF-κB，導致炎性介質大量釋放，造成肝臟損害[4-5]。可見，TLR4-NFκB信號通路異常與HSC異常增殖導致的肝纖維化密切相關[6]。文獻[7-8]及課題組研究發現，柴胡黃芩配可明顯防治大鼠肝纖維化，其作用機制可能與TLR4 -NFκB信號通路調控的炎癥反應有關[2]。柴胡皂苷d、黃芩苷為柴胡、黃芩的主要活性成分，兩者均有良好的抗肝纖維化作用[9-10]，本實驗研究柴胡皂苷d、黃芩苷對CCL4誘導活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κBp65基因及蛋白表達的影響，探討其抗肝纖維可能的作用機制。

結果表明，CCl4干預后，HSC大量增殖，其培養液中HA、LN、PCIII、IV-C含量明顯高于空白對照組(P<0.05)。可見，CCl4促進HSC增殖，并導致HA、LN、PCIII、IV-C分泌增加，促進肝纖維化。SB干預后，HSC增殖受到抑制，且HA、LN、PCIII、IV-C含量也降低，可見，SB有一定抗肝纖維化作用。同時，CCl4干預HSC后，細胞中TLR4和NF-κBp65 mRNA和蛋白表達均明顯增加，SB干預后，兩者mRNA表達和蛋白表達均明顯降低，其中SB 10 μg/ml時(P<0.05)作用最為顯著；應用TLR4的拮抗劑ATK-242，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達和蛋白表達明顯降低，應用NF-κBp65拮抗劑BAY 11-7082后，NF-κBp65 mRNA表達和蛋白表達也明顯降低，TLR4 mRNA表達和蛋白表達沒有明顯變化。可見，SB表現出一定抗肝纖維化作用，其作用機制之一是可能是通過調控TLR4-NF-κB信號通路，具體的調控機制，尚需深入研究。

[1] Sahin H，Trautwein C，Wasmuth H E．TLR4 stresses the liver[J]．Gut，2012，61：1241-1242.

[2] 王 斌，李 敏，侯建平.基于TLR4 -NFκB信號通路的柴胡-黃芩藥對抗肝纖維研究[J].中藥藥理與臨床，2015，31(3)：103-106.

[3] 李小菲，李 靜，王義雯，等.柴胡、柴胡和黃芩配伍對肝細胞損傷體外作用[J]. 吉林中醫藥，2016，36(2):176-180.

[4] Zhu Q，Zou L，Jagavelu K，etal．Intestinal decontaminationinhibits TLR4 dependent fibronectin-mediated cross-talk between stellate cells and endothelial cells in liver fibrosis inmice[J]．Hepatol，2012，56(4)∶893-899.

[5] Min Yu,Danbing Shao,Jian Liu,etal．Effects of ketamine on levels of cytokines，NF-κB and TLRs in rat intestine during CLP-induced sepsis[J].International Immunopharmacology,2007，7 (8):1076-1082.

[6] 李 冬，戴立里，余斌斌，等.丹參素對大鼠肝星狀細胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影響[J]. 第三軍醫大學學報，2009，31(8)：724-727.

[7] 鄭麗娜，韓 濤，王寶恩，等.柴胡對肝星狀細胞膠原蛋白分泌的影響[J]. 天津醫科大學學報，2001，7(4)：502-503.

[8] 劉林華，許景薇，萬玉英，等.豬牙皂正丁醇提取物體外對肝星狀細胞活性的影響研究[J].抗感染藥學，2015,12(6)：832-834.

[9] 郭景珍，萬 方，李 忻，等．柴胡皂苷d 對二甲基亞硝胺致肝纖維化大鼠炎癥相關因子的影響[J].中華中醫藥雜志，2008，23(11)：970-972.

[10] 劉志勇，葉 軍，薛東英.黃芩苷對肝纖維化大鼠相關細胞因子表達的影響[J].中國當代醫藥，2013 ，20(12) ：18-21.