延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法研究*

陳衍斌，何 娟，盧新義 ，馬久太，孫宇宏,孫寶平,劉 峰1,△

1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 (咸陽 712000)，2.陜西步長制藥有限公司(西安 710075)

延寄參膠囊是由延胡索、北劉寄奴、人參、骨碎補四味中藥組成的復(fù)方制劑，現(xiàn)代藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)延寄參膠囊對犬冠脈血流量及冠脈阻力具有較大影響，相對于對照藥地爾硫卓，延寄參膠囊能夠有效地增加犬動脈流量，降低冠脈阻力；在對大鼠心肌缺血模型的研究中，延寄參膠囊能夠降低缺血后再灌注引起的心律失常及心肌內(nèi)丙二醛(MDA)含量，同時能夠提升超氧化物歧化酶(SOD)活性；在對兔血小板聚集的影響研究中發(fā)現(xiàn)，與阿司匹林比較，該藥物能夠明顯延長血栓形成時間[1]。延寄參膠囊可以從多方面對動脈粥樣硬化所引起的病理損傷進行修復(fù)，緩解所引發(fā)的心臟不適癥狀，然而延寄參膠囊的化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，對其化學(xué)成分的研究工作十分重要。本文采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分進行分析。UPLC-Q-TOF-MS是一種將色譜的高效在線分離與質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨率完美結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)，能夠準確快速地對中藥復(fù)雜體系中的化學(xué)成分進行定性分析。目前，對延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的研究基本采用分離、提純、鑒定的方法，很少采用LC/MS分析法。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS法在正離子模式下對延寄參膠囊中的生物堿類化學(xué)成分進行了定性研究，旨在為延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分快速準確的分析提供方法，并為其止痛藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

儀器與試藥

1 儀 器 H-Class型超高效液相色譜儀、G2-XS QTOF型質(zhì)譜儀、Masslynx 4.1工作站(美國Waters公司)；DV215CD型電子天平(德國梅特勒公司)；KUDOS型超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；TDL-5A型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；優(yōu)普超純水機(成都超純科技有限公司)。

2 試 藥 延寄參膠囊(批號1607121、1607122、1607131)；色譜純甲酸(Sigma公司)；色譜甲醇、乙腈(美國Fisher公司)；水為脫氣高純水。

方 法

1 供試品溶液制備 稱取延寄參膠囊內(nèi)容物0.5g，于50ml的錐形瓶內(nèi)，加入25ml色譜甲醇，超聲30min后，將混懸液離心15min(5000r/min)，上清液用色譜甲醇稀釋100倍后，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。

2 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；流速為0.4 ml/min；柱溫為35℃；進樣體積為2μl；流動相為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；毛細管電壓：1.0 kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：800L/h；霧化氣壓力：35psi；碎裂電壓：135V；正離子模式下掃描檢測，一級質(zhì)譜掃描范圍：100-1000 m/z，二級質(zhì)譜掃描范圍：50-1000 m/z；參比離子設(shè)置為m/z 556.2771。

4 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件進行峰提取，UNIFI軟件進行峰識別，結(jié)合Massbank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻報道進行確證。

結(jié) 果

本研究在正離子模式下共定性鑒別出9種生物堿類化合物，按照保留時間的先后順序依次為四氫非洲防己堿、原阿片堿、延胡索乙素、小檗堿、海罌粟堿、黃連堿、延胡索甲素、非洲防己堿、氫化小檗堿。延寄參膠囊樣品溶液在正離子模式下的總離子流圖見圖1，總離子流圖中3-8min局部放大圖見圖2，各化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)詳見表2。

圖1 延寄參膠囊(批號1607121、1607122、1607131)醇提物總離子流圖(正離子模式)

圖2 延寄參膠囊(1607121)醇提物總離子流圖3～8min(正離子模式)

表2 延寄參膠囊(1607121)醇提物在正離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

本次研究檢出的生物堿類化合物按照結(jié)構(gòu)可以分為季胺類生物堿、叔胺類生物堿、原阿片堿類、阿樸菲類。以上各類化合物的裂解過程解析如下：

1 季胺類生物堿 化合物9的保留時間為6.91min，分子離子峰m/z338.1378為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z323.0125為 [M+H-CH3]+，m/z322.0045為 [M+H -CH3-H]+，特征碎片離子m/z 294.0321為 [M+H -CH3-H-CO]+。結(jié)合文獻[2]報道，推測該化合物為非洲防己堿。同理推測化合物4為小檗堿[3]。化合物6的保留時間為5.84min，分子離子峰m/z320.0912為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z292.0715為[M+H-CO]+，結(jié)合文獻[4]報道，推測化合物6為黃連堿。這三個化合物都屬于季胺類生物堿，結(jié)構(gòu)中的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)無法發(fā)生RDA 裂解，主要通過取代基的碎裂形成碎片離子。在正離子模式下均產(chǎn)生[M+H]+的分子離子峰，二級質(zhì)譜中鄰二甲氧基先失去1分子甲基后再失去1 個氫從而形成亞甲二氧基，亞甲二氧基會繼續(xù)丟失1分子一氧化碳從而形成1 個穩(wěn)定的三元氧環(huán)。黃連堿的結(jié)構(gòu)中無甲氧基取代，所以其裂解途徑為直接丟失C=O。

季胺類生物堿以小檗堿為例圖示其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖，見圖3。

圖3 化合物4(小檗堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

2 叔胺類生物堿 化合物3的保留時間是5.32min，分子離子峰m/z356.1851為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z341.1622為母離子失去一個取代基CH3而形成，即[M+H-CH3]+；m/z324.1532為母離子失去一個取代基CH3OH而形成，即[M+H-CH3OH]+；此外，母離子還會發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生m/z192.0902、165.0803的互補碎片離子，結(jié)構(gòu)中的四氫異喹啉部分為含氮碎片離子，苯環(huán)部分為互補碎片離子，結(jié)合文獻[5]報道，推測化合物3為延胡索乙素。同理可推測化合物1為四氫非洲防己堿[6]，化合物8為延胡索甲素[5]，化合物10為氫化小檗堿[7]。四氫非洲防己堿、延胡索乙素、延胡索甲素、氫化小檗堿均屬于叔胺類生物堿，結(jié)構(gòu)相似，在正離子模式下以[M+H]+分子離子峰形式存在，在二級質(zhì)譜中會出現(xiàn)RDA裂解形成互補的碎片離子。

叔胺類生物堿以延胡索乙素為例圖示其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖，見圖4。

圖4 化合物3(延胡索乙素)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

3 原阿片堿類 化合物2的保留時間是5.14min，分子離子峰m/z354.1336為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z206.0055和m/z149.0122兩個碎片離子為母離子發(fā)生RDA裂解所產(chǎn)生，結(jié)合文獻[8]報道，推測該化合物為原阿片堿。其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖見圖5。

圖5 化合物2(原阿片堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

4 阿樸菲類 化合物5的保留時間是5.74min，分子離子峰m/z 356.1849為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z 325.1418 碎片離子為分子離子丟失1分子甲氧基形成；碎片離子m/z 310.1178為分子離子丟失1分子甲氧基和1分子甲基所形成；碎片離子m/z 294.1231為分子離子丟失2分子甲基形成；碎片離子m/z 279.1002為分子離子失去2分子甲氧基和1分子甲基所形成。結(jié)合文獻[9]報道，推測化合物5為海罌粟堿。其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖見圖6。

圖6 化合物5(海罌粟堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

討 論

延寄參膠囊是一個由延胡索、人參、骨碎補、北劉寄奴四味中藥材組成的中藥復(fù)方制劑，化學(xué)成分體系較為復(fù)雜[10]。君藥延胡索入心肝脾經(jīng)，具有活血行氣止痛的功效，其所含的生物堿類化學(xué)成分具有較強的生物活性，是延寄參膠囊的主要藥效成分。通過上述研究共定性鑒別出9種生物堿類化學(xué)成分，分別是四氫非洲防己堿、原阿片堿、延胡索乙素、小檗堿、海罌粟堿、黃連堿、延胡索甲素、非洲防己堿、氫化小檗堿。本文首次采用高靈敏度、高分辨率的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)在同一條件下快速分析了延寄參膠囊中的生物堿類化學(xué)成分，為延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的快速鑒定提供了方法，同時也為闡明延寄參膠囊止痛類功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了可靠依據(jù)。

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