復方斑蝥膠囊對原發性肝癌患者介入治療后細胞免疫功能的影響*

趙延軍，單宇鵬

空軍軍醫大學唐都醫院腫瘤科 (西安 710038)

介入治療可通過碘油栓塞供應原發性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的動脈并進行局部灌注化療，但由于HCC患者存在免疫細胞功能衰竭或失能導致機體無法徹底清除腫瘤細胞[1]，造成治療后腫瘤復發及轉移，必須進行輔助藥物治療，重建機體免疫應答。復方斑蝥膠囊具有破血消瘀、攻毒蝕瘡的功效，有研究發現復方斑蝥膠囊具有升高白細胞的功能[2]。本研究觀察了復方斑蝥膠囊對HCC患者介入治療后細胞免疫功能的影響。

資料與方法

1 一般資料 參照2005年修訂的巴塞羅那(BCLC)原發性肝癌分期標準，選擇2016年9月至2017年6月在第四軍醫大學唐都醫院住院的原發性肝癌B期和C期患者42例，其中男性29例，女性13例，平均年齡(51.9±11.8)歲，所有患者在行介入治療前均未接受任何干預治療。采用隨機數字表法將其隨機分為2組，分別為介入治療組(21例)和介入治療后聯合復方斑蝥膠囊(國藥準字Z19993294，組方：斑蝥、人參、黃芪、刺五加、三棱、半枝蓮、莪術、山茱萸、女貞子、熊膽粉、甘草)治療組(21例)，復方斑蝥膠囊用量為1g/次，3次/d，連續服用4周。兩組間性別、年齡、臨床分期無顯著差異。同時選取第四軍醫大學唐都醫院健康體檢者20例(男性11例，女性9例，平均年齡49.1±6.9歲)作為健康對照組。

2 介入治療方法 經皮股動脈穿刺，在超滑導絲引導下降5F的RH導管頭端置于腹腔動脈，高壓注入適量碘佛醇行正位DSA，根據DSA顯影結果確定腫瘤供血動脈。將RH導管先端置于肝內供瘤沉積部位，緩慢灌注5-氟尿嘧啶、洛鉑或奧沙利鉑，再將碘油與吡柔比星充分混合后行栓塞術，根據患者個體情況和腫瘤大小確定用藥劑量。術畢退出導管，穿刺點加壓包扎止血。

3 試劑和儀器 淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司，抗人CD3-FITC、抗人CD4-PerCP Cy5.5、抗人CD8-APC、抗人CD56-PE、抗人CD19-APC購自美國BD公司， FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產品。

4 外周血單個核細胞(PBMC)分離和流式細胞檢測 分別于介入治療前和治療后4周收集入組志愿者的抗凝外周血10ml，利用密度梯度離心法分離PBMC，分別取106個PBMC轉入FACS管中，其中一管加入抗人CD3-FITC、抗人CD4-PerCP Cy5.5、抗人CD8-APC和抗人CD56-PE，另一管加入抗人CD19-APC，避光4°C孵育20min，應用PBS洗滌2次后加入2%多聚甲醛/PBS，上機檢測。使用CellQuest Pro軟件獲取細胞，使用FlowJo7.6.2軟件分析結果。

5 統計學方法 使用SPSS 19.0軟件對數據進行分析。使用Studentt檢驗對組間結果進行比較，使用配對t檢驗對治療前后結果進行比較。P<0.05認為差異具有統計學意義。

結 果

1 兩組患者接受介入治療前后肝功的變化 如表1所示，兩組患者在行介入治療前血清ALT、AST和T-BIL比較無明顯差異，治療后4周兩組患者之間比較肝功檢查亦無明顯差異。兩組患者ALT、AST和T-BIL水平在治療前后比較亦無明顯差異(P<0.05)。

表1 兩組原發性肝癌患者介入治療前后ALT、AST和T-BIL的變化

2 健康志愿者與原發性肝癌患者外周血免疫細胞比例的比較 應用流式細胞術檢測CD3+T細胞(圖1A)、CD4+T細胞(CD3+CD4+，圖1B)、CD8+T細胞(CD3+CD8+，圖1C)、NK細胞(CD3-CD56+，圖1D)、NKT細胞(CD3+CD56+，圖1D)、B細胞(CD19+，圖1E)的比例。如表2所示，原發性肝癌患者在行介入治療前CD3+T細胞、CD4+T細胞和NKT細胞的比例與健康志愿者比較無明顯差異，但原發性肝癌患者外周血CD8+T細胞、NK細胞和B細胞的比例較健康志愿者顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 健康志愿者與原發性肝癌患者外周血免疫細胞的比較(%)

注：與健康志愿者比較，*P<0.05

3 兩組原發性肝癌患者介入治療前后免疫細胞比例的變化 見表3。介入治療前外周血免疫細胞的比例在兩組患者之間無明顯差異。單純進行介入治療的患者中，治療4周后外周血免疫細胞的比例與治療前比較亦無明顯變化(P>0.05)。而在接受介入聯合復方斑蝥膠囊治療4周后，患者外周血CD8+T細胞和NK細胞的比例較治療前顯著升高(P<0.05)，但其它免疫細胞比例在治療前后無明顯變化(P>0.05)。

表3 兩組原發性肝癌患者介入治療前后外周血免疫細胞的比較(%)

注：與治療前比較，*P<0.05

A：CD3+T細胞，B：CD4+T細胞，C：CD8+T細胞，D：NK細胞和NKT細胞，E：B細胞圖1 典型流式細胞檢測分析

討 論

惡性腫瘤患者存在免疫功能失調，主要表現為免疫細胞表面多種抑制性受體(如：PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3等)表達升高，造成免疫細胞失能甚至功能衰竭，不能清除腫瘤細胞，導致腫瘤迅速進展和/或轉移的發生[3]。既往的許多研究均發現，原發性肝癌患者中存在多種免疫細胞的功能不全，特別是CD8+T細胞的功能衰竭[4-5]。在我國，原發性肝癌多由慢性肝炎病毒感染所致的肝硬化演變而來，慢性病毒感染和腫瘤雙重因素均加劇了免疫細胞功能衰竭，造成疾病的進展。本研究對原發性肝癌患者外周血中不同免疫細胞的比例進行了分析，并與健康志愿者進行了比較，發現原發性肝癌患者外周血中CD8+T細胞、NK細胞和B細胞的比例較健康志愿者顯著降低，但CD3+T細胞、CD4+T細胞和NKT細胞的比例與健康志愿者比較無明顯變化。CD8+T細胞和NK細胞均具有較強的免疫殺傷功能，CD8+T細胞是細胞毒性細胞，可通過分泌穿孔素、粒酶以及多種細胞因子特異性殺傷靶細胞[6]；NK細胞是固有免疫系統的重要組成部分，具有細胞毒功能和分泌細胞因子/趨化因子的能力，在無致敏情況下具有自發殺傷腫瘤細胞和受感染的靶細胞的功能，在機體對抗腫瘤和抗感染免疫中均發揮重要作用[7]。在原發性肝癌中，上述兩種細胞的數量降低可導致腫瘤細胞處于免疫逃逸狀態，不能被機體免疫系統識別殺傷，使病情進展。而活化的B細胞主要參與體液免疫，致敏后再次接觸同一抗原接觸時很快發生活化和分化，快速產生高水平特異性抗體，且維持時間長。在原發性肝癌中B細胞的水平和功能降低可能造成針對肝癌細胞的特異性抗體水平降低，亦不能殺傷腫瘤細胞，進一步導致病情進展。

目前針對惡性腫瘤的治療主要包括手術、化療、放療、生物治療等綜合治療手段。雖然既往的研究發現手術[2]和TACE介入治療[8]可部分恢復原發性肝癌患者的細胞免疫功能，但本研究發現，單純介入治療4周后原發性肝癌患者外周血免疫細胞的比例較治療前未見明顯升高。這可能與介入治療中使用局部化療藥物灌注，導致骨髓抑制有關。在中醫理論中，肝癌患者

屬于“癥積”范疇，治療上應扶正祛邪。既往的研究發現，重要聯合TACE介入治療可提高肝癌面者的細胞免疫功能[8-9]。復方斑蝥膠囊的組方中含有斑蝥、人參、黃芪、女貞子等，具有破血消瘀、攻毒蝕瘡的功效，以扶正祛邪、益氣活血、清熱解毒為治法[10]。本研究發現，原發性肝癌患者介入治療后聯合復方斑蝥膠囊口服4周，外周血中CD8+T細胞和NK細胞的比例明顯升高，說明受抑制的細胞免疫功能逐漸恢復，機體免疫力提高，CD8+T細胞和NK細胞殺傷腫瘤細胞的功能恢復，可進一步提升介入治療的效果，增強機體抗腫瘤的能力。但患者B細胞的數量與治療前比較未見明顯提高，可能與服藥時間尚短，機體體液免疫功能尚未完全恢復有關。

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