常壓室溫等離子體（ＡＲＴＰ）誘變快速選育對亞洲玉米螟高毒的蘇云金芽孢桿菌突變株

廖先清 周榮華 劉芳 張志剛 饒犇 陳偉 王開梅

摘要：采用常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株，選育對亞洲玉米螟高毒力突變株。經過4輪的ARTP誘變、鏡檢及搖瓶發酵篩選得到的突變株Bt-NBIC-380-18-407，其搖瓶發酵液對玉米螟二齡幼蟲效價達到6 835 IU/μL，殺蟲晶體蛋白含量6.3 mg/mL。該突變株的效價較初始菌株提高了25.7%，殺蟲晶體蛋白含量提高了18.9%。經過5次傳代，證實該突變株具有良好的遺傳穩定性。

關鍵詞：常壓室溫等離子體（ARTP）誘變;蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380;亞洲玉米螟;殺蟲晶體蛋白;生物效價

中圖分類號：S476.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0123-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.032? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Rapid Mutation Breeding of Highly Toxic Bacillus thuringiensis Strain Against Asian Corn Borer-by Atmospheric and Room Temperature Plasma

LIAO Xian-qing，ZHOU Rong-hua，LIU Fang，ZHANG Zhi-gang，RAO Ben，CHEN Wei，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/Biopesticide Subcenter of Hubei Science and Technology Innovation Center，

Wuhan 430064，China）

Abstract： A highly toxic Bacillus thuringiensis strain NBIC-380 against Asian corn borer was treated by atmospheric and room temperature plasma for improving the toxicity of the resulting mutants. Through 4 rounds of ARTP mutation and screening by microscopic checking，shake-flask fermentation and bioassay，one mutant designated as Bt-NBIC-380-18-407 with significant improvement of production of insecticidal crystal protein and potency-was obtained. The potency of the fermentation broth of the mutant against Asian corn borer larvae was increased 25.7% to 6 835 IU/μl，while the concentration of insecticidal crystal protein in fermentation broth was increased 18.9% to 6.3 mg/mL. The mutant showed rather good genetic stability after 5 times of consecutive transferring and cultivation.

Key words： ARTP mutagenesis; Bacillus thuringiensis; Asian corn borer;insecticidal crystal proteins; potency

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性桿狀細菌，形成芽孢的同時會產生具有殺蟲活性的伴孢晶體，對多種害蟲具有特異殺蟲活性，具有高效、安全及特異性強等特點，已成為目前開發時間最長、產量最大、應用最廣的生物殺蟲劑[1]，廣泛應用于各種農業、園藝、衛生害蟲等的防治，取得了巨大的經濟、生態和社會效益。自21世紀之后，中國的玉米種植面積就一直呈上升趨勢，溫室效應的出現、連茬種植、秸稈還田措施的推行、玉米密植技術的推廣，大大增加了玉米螟等病蟲害發生的可能性[2]。目前，防治玉米螟的主要方法是化學防治，但易產生抗藥性，用藥量逐年上升;而化學農藥的殘留，影響產品品質，尤其影響鮮食玉米的食品安全。蘇云金芽孢桿菌作為一種廣譜性強、殺蟲速度快、毒力高的生防微生物，在玉米螟的生物防治中發揮著重要作用。黑龍江省自2011年起已實施玉米螟綠色防控工程，采用湖北康欣農用藥業有限公司生產的玉米螟專用蘇云金桿菌可濕性粉劑和油懸浮劑，采取飛機噴霧或自走式高桿噴霧車地面噴霧大面積防治，取得了很好的防效。對玉米螟高毒力的蘇云金芽孢桿菌的分離、選育是玉米螟綠色防控效果的關鍵因子。

誘變育種技術仍然是現在世界各國廣泛使用的菌株選育技術，傳統的誘變育種方法如紫外線輻照（UV）、亞硝基胍（NTG）、Co60γ射線輻照等方法都頗有成效[3]，但UV能量較大，會殺死細胞，極易對人體造成巨大傷害;NTG有毒，有致癌的可能性;電離輻射有一定的局限性，操作要求高且有一定的危險性，因此傳統的誘變方法對試驗操作者的人身安全有很大的潛在危險。由清華大學自主研發的新型常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術是新興的一種誘變技術，因其具有基因損傷強度高、突變范圍廣、處理條件溫和、安全無輻射、操作便捷等優點[4]，已廣泛應用于工業發酵高產菌株。本研究以實驗室篩選保存的對玉米螟有特異性、高毒力的蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株為出發菌株，通過ARTP誘變育種，篩選獲得一株遺傳性能穩定、對玉米螟毒力得到明顯提高的突變菌株，其發酵液生物效價和殺蟲晶體蛋白含量均有所提高，為玉米螟綠色防控工程提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株? 蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株，湖北省生物農藥工程研究中心從土壤中分離篩選。

1.1.2? 供試蟲? 玉米螟采自黑龍江省，由湖北省生物農藥工程研究中心養蟲室保種并培養，提供供試二齡幼蟲。

1.1.3? 培養基? 牛肉膏蛋白胨培養基，牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH調至6.8～7.2。發酵培養基，玉米淀粉30 g/L、酵母浸粉? ?5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgS04·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 1 g/L、花生餅粉20 g/L、魚粉10 g/L，pH調至7.5。培養基滅菌溫度為121 ℃，時間為30 min。

1.1.4? 試劑與儀器? 常壓室溫等離子體誘變機（無錫源清天木生物科技有限公司）;恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）;搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）;721可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2? 菌株的ARTP誘變

1.2.1? 芽孢懸浮液的制備? 將保藏于砂土管的蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌種直接轉接于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養基上進行復壯，置于30 ℃恒溫培養箱中培養4 d，挑起一環菌苔轉接于牛肉膏蛋白胨液體搖瓶中（100 mL/500 mL三角瓶），220 r/min，30 ℃振蕩培養至芽孢全部形成。離心收集芽孢，然后無菌水稀釋，制備一定濃度的芽孢懸液，OD600 nm在0.3～0.5，作為誘變母液。

1.2.2? 菌株的ARTP誘變? 在超凈工作臺中用移液槍移取10 μL的誘變母液，均勻涂抹在直徑為6 mm的無菌金屬墊片上，將其置于無菌平皿內移至提前開機預熱20 min的ARTP誘變機中，電源功率為100 W，處理距離2 mm，工作氣流量10 slpm，以氦氣為工作氣體，以處理時間為誘變的主要操作參數，誘變時間設置為20、40、60、80、100、120 s。誘變處理完成以后取出金屬墊片放入裝有1 mL無菌水的EP管中，渦旋振蕩1 min。取經振蕩的菌液稀釋至適當濃度涂平板，放入30 ℃恒溫培養箱中培養2 d。經上述條件培養后，計數各平板上單菌落個數，取3次平均值，繪制出致死率曲線。

1.2.3? ARTP誘變致死率的計算? ARTP誘變致死率的計算參照以下公式：

致死率=（A-B）/A×100%

式中，A為誘變處理前芽孢懸液的活芽孢濃度;B為誘變處理后芽孢懸液中活芽孢濃度。

1.3? 誘變菌株的篩選

1.3.2? 搖瓶篩選? 將斜面鏡檢確定的芽孢形成率高、營養體少、晶體比例高、晶體整齊的突變株接種于搖瓶發酵培養基中（500 mL三角瓶每瓶裝量50 mL），30 ℃，220 r/min振蕩培養30 h，涂片染色后鏡檢。

1.3.3? 發酵液生物效價測定和殺蟲晶體蛋白質含量測定? 挑取搖瓶發酵鏡檢確定的芽孢形成率高于90%、菌體整齊、生長速度快、晶體大小整齊的突變株發酵液進行生物效價測定和殺蟲晶體蛋白含量測定。

1.3.4? 砂土管保存? 挑取發酵液生物效價和殺蟲晶體蛋白含量均高于出發菌株10%以上的菌株，刮下芽孢放入已滅菌并經無菌檢查的砂土管中，用接種環打散混勻，置于干燥器中保存。

1.4? 生物活性測定和殺蟲晶體蛋白含量測定

1.4.1? 對玉米螟生物活性測定? 生物活性測定采用混菌法，參照國家標準GB/T 19567.1-2004中棉鈴蟲生物測定方法進行[5];將發酵液稀釋至一定濃度，每樣品設3個濃度，取適量與飼料混合均勻，倒入24孔板，晾干后接玉米螟二齡幼蟲，設空白對照和標準品對照，封嚴24孔板，于25 ℃培養72 h，檢查各處理死亡及存活蟲數，并計算發酵液生物效價[6]。

1.4.2? 殺蟲晶體蛋白含量測定? 參照國家標準GB/T 19567.1-2004中蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白含量測定方法進行[5]。

1.5? 數據處理及分析方法

生物測定數據采用SPSS軟件進行分析，計算LC50和95%置信區間[7]。

1.6? 突變株遺傳穩定性分析

在斜面培養基上活化篩選得到高毒力的菌株，培養96 h，連續在斜面上轉接5次進行搖瓶發酵，分別進行顯微鏡檢芽孢形成率、生物活性測定、殺蟲晶體蛋白含量測定，比較突變株毒力的穩定性。

2? 結果與分析

2.1? ARTP誘變時間的選擇

不同誘變時間下蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株芽孢懸液ARTP處理的致死率曲線如圖1所示。從圖1中看出，隨著處理時間的增加，菌體的存活率逐漸降低。40 s以后，致死率大幅度上升，這說明蘇云金芽孢桿菌Bt-NBIC-380菌株對ARTP較敏感，產生的致突變能力較大，處理60 s后致死率在90%左右，但當作用時間達到80 s時，ARTP的誘變作用較為劇烈，致死率達到95.6%。當處理時間100 s時，致死率接近100%。綜合考慮菌株致死率、菌株的生物活性，為提高獲得生產能力和生存能力較強菌株的概率，故選定致死率到達80%～90%左右作為誘變依據[8，9]，本研究中選定ARTP處理時間為60 s，此時致死率為89.3%。

2.2? 高產突變株的篩選

2.2.1? 斜面初篩? 將ARTP誘變時間60 s并經5次單菌落分離得到的749株斜面進行涂片鏡檢，斜面鏡檢芽孢形成率高、營養體少、晶體率高、晶體整齊的菌株，共得到76株優勢菌株進行下一輪搖瓶發酵。5次鏡檢初篩優勢菌株比例在10%左右，鏡檢情況如表1所示。

2.2.2? 搖瓶篩選? 將斜面鏡檢初篩得到的76株優勢菌株進行搖瓶發酵，并設出發菌株作對照。30 h分別涂片鏡檢，得到15株發酵芽孢形成率高于95%，菌體整齊，對晶體大、形態好的突變株分別進行生物活性測定和殺蟲晶體蛋白含量測定，3次重復取平均值，結果如表2所示。采用生物效價和晶體蛋白雙指標進行高毒力突變菌株的判定，生物效價和晶體蛋白含量均高于出發菌株20%的菌株有7株，分別是NBIC-380-401、NBIC-380-402、NBIC-380-406、NBIC-380-407、NBIC-380-410、NBIC-380-411、NBIC-380-415。

2.3? 高毒力突變株的搖瓶復篩

將搖瓶篩選得到的7株高毒力突變株進行搖瓶發酵，并設出發菌株作對照。30 h分別涂片顯微鏡檢，進行生物活性和殺蟲晶體蛋白含量測定，3次重復取平均值，結果如表3所示。綜合搖瓶發酵芽孢形成率、發酵周期、生物效價和晶體蛋白含量，NBIC-380-402、NBIC-380-407兩菌株各種指標均優于其他菌株，其中NBIC-380-407菌株效價較出發菌株提高25.7%，晶體蛋白含量提高18.9%，發酵性能優良。

2.4? 突變高毒力菌株的遺傳穩定性

為了檢測突變株的遺傳穩定性，對突變高產株NBIC-380-18-407在試管斜面上連續轉接5代，顯微鏡檢，然后進行搖瓶發酵培養，檢測發酵液的生物效價和殺蟲晶體蛋白含量，結果（表4）表明，隨著傳代次數的增加，菌株的晶體形態、芽孢形成率、發酵液的殺蟲活性及殺蟲晶體含量等各項指標無明顯變化，至第5次傳代后也較為穩定。這說明通過ARTP誘變所獲得的突變株NBIC-380-18-407具有良好的遺傳穩定性，可作為工業生產菌株。

3? 討論

化肥農藥減施增效是關系到中國農產品品質和食品安全的戰略性問題。通過傳統菌種選育、誘變育種及現代分子技術手段，建立高效快速的高活性菌株選育方法與手段，篩選獲得高活性或高生態適應性的菌株，創制安全高效的生物殺蟲劑，有助于改變中國食品安全現狀，具有廣闊的發展前景，其社會效益和經濟效益是顯而易見的。誘變育種是工業化生產中選育高活性菌株的重要有效手段。相對于其他傳統誘變技術，ARTP誘變育種具有操作簡便、設備簡單、條件溫和、安全性高、一次操作可獲得大量的突變體等優異性能，達到高效育種的目的。本研究利用ARTP對玉米螟高毒力菌株蘇云金芽孢桿菌NBIC-380進行誘變，通過斜面鏡檢初篩、搖瓶三輪復篩，獲得發酵效價6 835 IU/μL晶體蛋白含量6.3 mg/mL，并且遺傳穩定的突變菌株NBIC-380-18-407，建立了一套高效的篩選方法，為芽孢桿菌的菌種選育提供了參考方法。突變株發酵水平較初始菌株提高20%以上，提升了產品質量，在工業化大規模生產中可顯著降低生產成本。

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