枯草芽孢桿菌的發酵培養基優化研究

饒犇 周榮華 閔勇 廖先清 劉芳 陳偉 張光陽

摘要：為了得到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵的最佳培養基，應用Plackett-Burman設計法對影響枯草芽孢桿菌芽孢形成的關鍵因子進行篩選，并進一步采用響應面分析法對影響芽孢產量的關鍵因素進行研究。結果表明，影響枯草芽孢桿菌芽孢產量的關鍵因素為玉米淀粉和豆粕的濃度。通過響應面分析法的擬合和推算，得到玉米淀粉和豆粕濃度分別為2.48、4.90 g/mL時，此時模型預測發酵最佳產量為105億/mL，驗證值為110億/mL，預測值與驗證值之間吻合較好，比優化前實際產量（80億/mL）提高了37%。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;Plackett-Burman設計法;響應面分析法

中圖分類號：Q813.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0127-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.033? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimizing on Fermentation Conditions of Bacillus subtilis by Response Surface Analysis Methodology

RAO Ben，ZHOU Rong-hua，MIN Yong，LIAO Xian-qing，LIU Fang，CHEN Wei，ZHANG Guang-yang

（National Biopesticide Engineering Technology Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to obtain the optimal medium composition for Bacillus subtilis production，the Plackett-Burman design method was used to evaluate the effects of five variables，and the optimum levels of key factors affecting spore production were conducted by response surface analysis methodology. The results showed that，the optimal values of the two parameters determined by response surface analysis methodology were corn starch 2.48 g/mL and corn-soybean 4.90 g/mL. The predicted spore production was 1.05×1010 CFU/mL，and the actual experimental result was 1.10×1010 CFU/mL，they were in agreement and it is 1.37 folds of the production before optimization （8×109 CFU/mL）.

Key words： Bacillus subtilis; Plackett-Burman design method; response surface analysis methodology

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種常用的微生物源生物農藥?？莶菅挎邨U菌在防治水稻、小麥、花生、番茄、辣椒、大豆、玉米等作物的病害上有較好的效果，特別是針對小麥白粉病、赤霉病、紋枯病等病害的防治效果更佳，田間增產率達到了10%～50%[1-4]。

枯草芽孢桿菌具有很強的營養物質競爭能力以及氧氣競爭優勢;定殖、繁殖速度很快，迅速抑制其他病原微生物生存，起到保護植物、確保植物健康生長的作用。此外，枯草芽孢桿菌對人畜無毒無害、不污染環境、對作物安全;能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力;還能分泌促進作物生長的活性物質，使植株葉片濃綠肥厚，提高作物免疫力，增產提質效果顯著，發酵過程中產生多種氨基酸，對作物有生長調節的作用[5-9]。

枯草芽孢桿菌主要是以3種方式起作用，一是競爭作用：拌種或灌根后，枯草芽孢桿菌能夠在作物周圍、根表面、根內部以及通過植物導管傳導到地上部分而在作物根表、根內、莖部、葉部等位點定殖和繁殖，保護作物根部不受病菌侵染和抑制作物體內病原菌擴散，從而達到防病作用。二是殺菌作用：枯草芽孢桿菌在作物根表、根內、莖部、葉部等位點定殖和繁殖過程中，能產生脂肽類和蛋白類等殺菌物質，從而殺死作物病原菌，達到防病效果。三是促生作用：枯草芽孢桿菌具有解磷作用，可以將土壤中無效磷轉化為能被作物吸收的有效磷，促進作物根系及植株生長，提高了作物的抗病性。

本研究以實驗室自行分離得到的枯草芽孢桿菌NBF-809菌株為研究對象，對其培養基和培養條件進行Plackett—Buman試驗，篩選顯著的影響因子，然后通過響應面試驗組合設計，擬合數學模型方程，從而找到最優條件組合，并對其試驗結果進行評估，以期初步篩選比較合適的培養基配方。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

1.1.1? 菌種? 實驗室自行分離，鑒定為枯草芽孢桿菌，編號為NBF-809。

1.1.2? 培養基? 固體培養基為LB培養基。種子培養基配方：淀粉10.0 g/L， 酵母浸粉5.0 g/L，磷酸氫二鈉0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH 7.0。發酵培養基初始配方：淀粉15.0 g/L，豆粕20.0 g/L，磷酸二氫鉀 1.0 g/L，磷酸氫二鈉0.5 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.2 g/L。后期采用優化后配方。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 發酵培養條件? 接種體積分數2%，發酵溫度30 ℃，搖床轉速200 r/min，發酵48 h。

1.2.2? Plackett-Burman試驗? 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養基成分進行考察，篩選影響枯草芽孢桿菌芽孢數的重要因素，確定最佳配方。設計水平和排列方式見表1。

1.2.3? 最陡爬坡試驗? 根據Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，另外步長確定亦與試驗條件相關。

1.2.4? 中心組合設計和響應面分析? 對Plackett-Burman試驗確定的因素，以最陡爬坡試驗得到的中心點，根據中心組合設計原理安排響應面試驗獲得重要因素的最佳配方水平。根據中心組合設計結果來擬合數據，得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

其中，Y是產物能力測量值，b0是截距，bi是關鍵因素線性效果的系數，bii是關鍵因素的二次效應系數，bij是關鍵因素間交互作用的系數。

根據擬合的數學模型以及方差分析的結果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面圖和等高線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合的數學方程求解最優結果。

1.2.5? 培養基優化結果驗證試驗? 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，發酵結束后測定發酵液中的菌絲重量。

2? 結果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗結果

據前期研究結果，確定以玉米淀粉和葡萄糖為碳源，以蛋白胨、玉米漿和豆粕為氮源，共5種因素（X1玉米淀粉、X2葡萄糖、X3蛋白胨、X4玉米漿、X5豆粕）一起進行Plackett-Burman設計試驗，設計方案和試驗結果見表1。

由t檢驗結果可知，玉米淀粉和豆粕對枯草芽孢桿菌的生長和芽孢形成具有顯著影響，可信度在95%以上，且兩者對枯草芽孢桿菌的生長影響是正效應。

由上述Plackett-Burman試驗得到的回歸方程為Y=75+5.67X1+0.83X2+0.5X3-X4+11X5，方程擬合的相關性為R2=98.01%，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman的試驗結果。

2.2? 最速爬坡試驗結果

找到對產物發酵影響最大的因素后，需要進一步對這些因素進行分析。最速上升法以前述Plackett-Burman設計試驗得到的一次方程為基礎，以相應因素的系數比為基準進行步移，直到步移至最高點，然后以最高點附近的范圍作為響應面優化的相應范圍。從Plackett-Burman設計試驗得到方程中玉米淀粉和豆粕的系數（X1=5.67，X2=11），可以得到這兩個因素步移的步長比為1.00∶1.94，即當玉米淀粉步移1.00個單位（0.20 g/L）時，豆粕也步移1.94個單位（0.38 g/L）。以Plackett-Burman設計中的中心點作為步移的起點，試驗設計與試驗結果如表2所示。從試驗結果（表2）可以看出，枯草芽孢桿菌芽孢的產量在步移進行至第三步時達到最高點，之后芽孢產量開始下降。步移最高點時，玉米淀粉和豆粕的濃度分別為2.40、4.76 g/mL，這一點被用作下一步響應面分析的中心點。

2.3? 中心組合設計試驗結果

根據以上Plackett-Burman試驗可知，影響枯草芽孢桿菌芽孢形成的2個重要因素分別是玉米淀粉和豆粕。根據中心優化組合方法，試驗設計及結果見表3，共13組試驗。

以玉米淀粉和豆粕為自變量，以枯草芽孢桿菌的芽孢數為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為Y=103+9.505X1+3.013X2-5.5X12-6.5X22+3X1X2，Y為響應值，X1為玉米淀粉，X2為豆粕。利用Minitab軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1=2.48 g/mL，X2=4.90 g/mL，在此條件下理論預測得到的值為105億/mL。

2.4? 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化條件進行了驗證試驗，共做了3組平行試驗。結果表明，枯草芽孢桿菌的芽孢數為110億/mL，比預測值更好一些。

3? 小結

對枯草芽孢桿菌生長培養基進行了優化研究，得到最佳培養基配方，玉米淀粉2.48 g/mL，葡萄糖2.00 g/mL，蛋白胨2.00 g/mL，玉米漿1.00 g/mL，豆粕4.90 g/mL。在此條件下，枯草芽孢桿菌的芽孢數理論最高產量為105億/mL，驗證試驗中最高值為110億/mL，與理論預測相符，比優化前實際產量（80億/mL）提高了37%。

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