細胞自噬對巖大戟內(nèi)酯B誘導的白血病細胞HL—60凋亡的影響

王佳賀 王超

[摘要] 目的 探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和自噬激動劑雷帕霉素（RAPA）對巖大戟內(nèi)酯B誘導的人白血病細胞系HL-60細胞凋亡的影響。 方法 采用Western blot分析檢測不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B作用不同時間后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬調(diào)節(jié)因子Beclin-1等的表達；將HL-60細胞分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測人白血病細胞系HL-60細胞的凋亡情況；檢測Caspase-3蛋白酶的活性。 結(jié)果 巖大戟內(nèi)酯B能夠誘導白血病細胞HL-60自噬，增加LC3-Ⅱ和自噬調(diào)節(jié)因子Beclin-1的表達（P < 0.05）；3-MA可降低巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡和Caspase-3的活性（P < 0.05），而RAPA則提高了巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡率及Caspase-3的活性（P < 0.05）。 結(jié)論 巖大戟內(nèi)酯B可誘導HL-60細胞自噬，細胞自噬在巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡中起到了非常重要的作用。

[關鍵詞] 巖大戟內(nèi)酯B；白血病；HL-60細胞；細胞凋亡；自噬

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（a）-0013-04

Effect of cell autophagy on apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B

WANG Jiahe WANG Chao

Department of Geriatrics， Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110004， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of apoptosis of the autophagy-specific inhibitor 3-methyladenine （3-MA） and autophagy agonist rapamycin （RAPA） on the human leukemia cell line HL-60 cells induced by Jolkinolide B. Methods The expressions of autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand autophagy regulator Beclin-1 induced by different doses of Jolkinolide B at different time points were detected by Western blot method. The HL-60 cells were divided into blank control group， Jolkinolide B group， Jolkinolide B combined with 5 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 nmol/L RAPA group and Jolkinolide B combined with 20 nmol/L RAPA group. Apoptosis of human leukemia cell line HL-60 cells was detected by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry. Moreover， the activity of Caspase-3 was detected. Results Jolkinolide B could induce autophagy in leukemia cell line HL-60， increase the expression of LC3-Ⅱ and autophagy regulator Beclin-1 （P < 0.05）. 3-MA could lower the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 activity induced by Jolkinolide B （P < 0.05）， while RAPA increased the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 induced by Jolkinolide B （P < 0.05）. Conclusion Jolkinolide B can induce autophagy in HL-60 cells， and autophagy plays an important role in the apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B.

[Key words] Jolkinolide B； Leukemia； HL-60 cell； Apoptosis； Autophagy

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病[1]。目前認為細胞自噬廣泛參與了白血病的發(fā)生[2-3]。中藥具有價格低廉、來源豐富等特點，且在干預腫瘤細胞的自噬過程中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。研究表明[7-9]，從中藥狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）根部分離的二萜類化合物巖大戟內(nèi)酯B能夠抑制多種白血病細胞增殖，促進白血病細胞凋亡。然而，巖大戟內(nèi)酯B能否誘導白血病細胞自噬以及自噬與凋亡關系的研究目前鮮有報道。

因此，本研究在前期研究的基礎上，通過體外實驗探討巖大戟內(nèi)酯B是否能夠誘導白血病細胞自噬、自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）及自噬激動劑雷帕霉素（RAPA）是否能夠影響巖大戟內(nèi)酯B所致的白血病細胞的凋亡。初步探討巖大戟內(nèi)酯B能否誘導HL-60細胞自噬并觀察調(diào)控自噬對巖大戟內(nèi)酯B誘導的白血病細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；3-MA和RAPA購自Sigma公司；自噬相關抗體LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、β-actin及其他試劑均為武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國Backman公司產(chǎn)品；離心機購自德國Eppendorf公司；HL-60細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blot檢測白血病細胞HL-60自噬調(diào)節(jié)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達

采用巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細胞24、48、72 h或采用濃度分別為0、20、40、80 μg/mL巖大戟內(nèi)酯B處理HL-60細胞48 h后，常規(guī)消化并收集各組細胞，按照總蛋白抽提試劑盒的操作步驟提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白的濃度。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）電泳。在恒定電流下電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h。加入1∶1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次；加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min。用抗β-actin抗體標記。按試劑盒說明，采用發(fā)光試劑浸潤PVDF膜，膠片在感光屏內(nèi)曝光成像后，結(jié)果在凝膠成相儀上照相。本實驗重復3次。

1.4 巖大戟內(nèi)酯B作用于HL-60細胞分組

將HL-60細胞分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組，分別培養(yǎng)24 h。

1.5 流式細胞儀檢測HL-60細胞的凋亡率

取對數(shù)生長期的HL-60細胞，分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。巖大戟內(nèi)酯B、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的3-MA和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的RAPA分別處理24 h后收集HL-60細胞，將細胞懸于300 μL的Binding Buffer，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶（PI），輕輕混勻，避光，室溫反應15 min，流式細胞儀檢測各組HL-60細胞的凋亡率。

1.6 Caspase-3活性測定

巖大戟內(nèi)酯B、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的3-MA和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的RAPA分別處理HL-60細胞24 h后，比色法檢測Caspase-3的活性。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 巖大戟內(nèi)酯B對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表達的影響

巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細胞24、48、72 h后或不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細胞48 h后，細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大，Beclin-1蛋白表達亦逐漸增加。Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 流式細胞儀分析HL-60細胞的凋亡率

巖大戟內(nèi)酯B組HL-60細胞的凋亡率與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組及巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組的HL-60細胞凋亡率均下降，而巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組的HL-60細胞凋亡率均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2。

1：空白對照組；2：巖大戟內(nèi)酯B組；3：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組；4：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組；5：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組；6：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。與空白對照組比較，#P < 0.05；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，*P < 0.05

圖2 不同處理組白血病細胞HL-60的凋亡率

2.3 Caspase-3活性

巖大戟內(nèi)酯B組的HL-60細胞Caspase-3活性與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組的HL-60細胞Caspase-3活性均下降，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組的HL-60細胞Caspase-3活性均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖3。

1：空白對照組；2：巖大戟內(nèi)酯B組；3：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組；4：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組；5：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組；6：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。與空白對照組比較，#P < 0.05；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，*P < 0.05

圖3 不同處理組白血病細胞HL-60的Caspase-3活性

3 討論

大量研究表明[10-11]，抗腫瘤藥物的作用機制之一是調(diào)節(jié)腫瘤細胞自噬的發(fā)生。自噬是一種細胞程序性死亡方式。不同種類藥物作用于白血病患者的效果會因自噬效應的不同而有所差別。LC3是重要的自噬標記分子[12]。LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式。LC3前體形成后，首先被加工成LC3-Ⅰ，其為胞質(zhì)可溶性形式，被Atg7活化；后者再經(jīng)過修飾生成LC3-Ⅱ，其為膜結(jié)合形式，并且定位于自噬前體和自噬體，最后被水解酶水解。LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在一定程度上與自噬體數(shù)量成正比，并反映了自噬活性[13]。Beclin-1亦是參與自噬調(diào)控的重要基因，是哺乳動物與酵母自噬相關基因Atg6/Vps30同源的基因，其表達強度與自噬活性密切相關[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用巖大戟內(nèi)酯B處理HL-60細胞，細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達隨著大戟內(nèi)酯B濃度的增加及作用時間的延長均增強，進一步說明LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白參與了巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60的自噬性細胞死亡。因此，靶向調(diào)控自噬性細胞死亡途徑可能成為治療白血病的新方法之一。

此外，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，即某些情況下能夠抑制細胞凋亡，而在某些情況下又能促進細胞發(fā)生凋亡[17-18]。為了探討巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞自噬與細胞凋亡的相關性，本研究分別聯(lián)用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑RAPA，觀察自噬對巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡的影響。本結(jié)果顯示，HL-60細胞經(jīng)3-MA預處理后，巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡率降低；HL-60細胞經(jīng)自噬激動劑RAPA預處理后，巖大戟內(nèi)酯B誘導的HL-60細胞凋亡率增加。提示抑制巖大戟內(nèi)酯B誘導的自噬能夠抑制HL-60細胞凋亡，巖大戟內(nèi)酯B與自噬激動劑RAPA的聯(lián)合應用可能為白血病的臨床治療提供新策略。

細胞自噬和凋亡的信號通路中存在著眾多的交叉，白血病細胞自噬和凋亡的具體關系仍不十分清楚[19-20]。促進或抑制細胞自噬，進而提高白血病的化療效果，可能成為未來白血病治療的策略之一。繼續(xù)深入探討巖大戟內(nèi)酯B誘導的白血病細胞自噬和凋亡的關系以及各相關信號轉(zhuǎn)導通路在細胞自噬和凋亡過程中的作用，以便為通過促進或抑制細胞自噬的發(fā)生治療白血病提供一定的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-11-07 本文編輯：任 念）