化學(xué)因子對藍曼龍精子活力的影響

王 璞，王茂林，姜玉聲，王 偉

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點開放實驗室，遼寧大連 116023；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

藍曼龍(Trichogastertrichopterus)屬于鱸形目攀鱸亞目絲足鱸科，又稱絲足鱸，是藍星魚的人工變種品種[1]。身體為橢圓形，側(cè)扁；尾鰭呈叉狀，腹鰭胸位，為長絲狀。魚體呈藍灰色，體側(cè)有兩塊不規(guī)則的深藍色斑塊，一般情況下，這兩塊斑塊會連接形成一條深藍色的斑塊。腹鰭邊緣具有微微的淺黃色；背鰭、腹鰭和尾鰭的淺藍灰底色上分布著艷藍色斑點。藍曼龍在沒有性成熟之前，雌魚和雄魚沒有太大區(qū)別。成熟后，雌魚腹部較飽滿，背鰭圓而鈍，體色較黯淡，絲狀胸鰭基部紅色不明顯，雄魚性狀與之相反。親魚性成熟年齡為6個月，成熟的藍曼龍游動起來非常緩慢，但這種魚攻擊性很強，喜歡攻擊比它弱小的同種或異種魚類。藍曼龍魚體鮮艷好看，幼魚經(jīng)常去水面吐泡泡，十分滑稽可愛，它對水質(zhì)的適應(yīng)能力較強，所以是被觀賞魚愛好者廣泛養(yǎng)殖的品種[2]。

目前只有少數(shù)學(xué)者對藍曼龍的生長、繁殖和生物學(xué)進行了研究。魏東等[1]和董艷珍等[3]研究了藍曼龍魚的人工養(yǎng)殖及繁殖；鄭曙明等[4]研究了pH和硬度對曼龍魚孵化率和稚魚成活率的影響；陳友鈴等[5]研究了藍曼龍的染色體組型；胡傳路等[6]對藍曼龍配合飼料中最適蛋白含量進行了初步研究。該研究分析了不同濃度KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2溶液對藍曼龍精子活力的影響，以期為藍曼龍的人工繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料試驗用魚購自大連市香爐礁觀賞魚市場，挑選體色鮮艷、健康活潑、體型較大的雄魚20尾，體長(15.0±0.5)cm。試驗用魚放于實驗室中在水溫27 ℃下進行暫養(yǎng)管理，為采集精液做準備。

1.2KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2溶液配制試驗采用分析純的 KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2試劑，再分別用純水配制成10個濃度梯度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L，純水作對照。

1.3精液采集及精子活力觀察將撈出的雄魚放置在冰袋上，等魚體靜止后，用紙巾擦干魚體表的水分，解剖獲取乳白色的5期性腺，再將收集到的性腺勻漿后放置在培養(yǎng)皿中保存。

打開顯微鏡，利用干燥的針頭在載玻片上涂抹少量的藍曼龍精液，放在40×10倍的光鏡下，在載玻片的精液上滴1滴配制好的試劑，快速用針頭攪拌均勻后觀察精子活力。精子活力是指精子從開始運動起到視野內(nèi)90%的精子停止顫動的時間[7]，用秒表計時。每個濃度試驗重復(fù)3次以上。

1.4數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，用Excel軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1KCl、NaCl溶液對藍曼龍精子活力的影響KCl處理下對照組精子活力為56 s，試驗組精子活力為34～245 s。由圖1可知，KCl濃度很小時(0.1、0.2 g/L)，其對藍曼龍精子活力的影響并不大。當KCl濃度上升到0.3 g/L時，其對藍曼龍精子活力有了提高的作用。KCl濃度從0.3～0.5 g/L時，精子活力快速增加，在濃度為0.5 g/L時達到最高，為245 s。當KCl濃度高于0.5 g/L時，精子活力逐漸下降。

圖1 不同濃度KCl溶液對藍曼龍精子活力的影響Fig.1 The effects of different concentrations of KCl solution on sperm motility of T. trichopterus

NaCl處理下，對照組精子活力為56 s，試驗組精子活力為4～103 s。由圖2可知，加入較低濃度的NaCl溶液對精子活力有明顯的提升作用，激活率也逐漸升高，當加入的NaCl濃度為0.1～0.4 g/L時，精子活力不斷升高。當NaCl濃度為0.4 g/L時，藍曼龍精子活力達到最高，為103 s，此后再增加NaCl濃度，精子活力呈明顯下降趨勢。NaCl濃度高于0.8 g/L時，已經(jīng)觀察不到精子活動。

圖2 不同濃度NaCl溶液對藍曼龍精子活力的影響Fig.2 The effects of different concentrations of NaCl solution on sperm motility of T. trichopterus

2.2CaCl2、MgCl2溶液對藍曼龍精子活力的影響CaCl2處理下，對照組精子活力為56 s，試驗組精子活力為0～26 s。由圖3可知，加入較低濃度的CaCl2溶液對精子活力具有顯著的抑制作用。當CaCl2濃度為0.4 g/L時，藍曼龍精子活力達最高值(26 s)。此后再增加CaCl2濃度，精子活力逐漸消失。當CaCl2濃度高于0.8 g/L時，已經(jīng)觀察不到精子運動。

圖3 不同濃度CaCl2溶液對藍曼龍精子活力的影響Fig.3 The effects of different concentrations of CaCl2 solution on sperm motility T. trichopterus

MgCl2處理下，對照組精子活力為56 s，試驗組精子活力為2～20 s。由圖4可知，加入較低濃度的MgCl2溶液對精子活力具有明顯的抑制作用。當MgCl2濃度為0.3 g/L時，藍曼龍精子活力達到最高值(20 s)。此后再增加MgCl2濃度，精子活力逐漸消失。當MgCl2濃度高于0.4 g/L時，已經(jīng)觀察不到快速運動的精子。

圖4 不同濃度MgCl2溶液對藍曼龍精子活力的影響Fig.4 The effects of different concentrations of MgCl2 solution on sperm motility T. trichopterus

3 討論

3.1Na+、K+對精子活力的影響魚類的精巢中，除了精液外，還存在許多其他物質(zhì)。其中有一些抑制精子活動的因素，它們可以通過減緩運動強度來減少精子能量的消耗。一方面促進了精子的成熟，另一方面也保障了精子的儲存。因此，到了繁殖季節(jié)，雄魚可以持續(xù)不斷地產(chǎn)出有活性的精子[8-9]。

試驗結(jié)果顯示Na+和K+在調(diào)控魚類精子活力方面起到了重要作用。研究表明，Na+、K+對不同魚類精子的調(diào)控結(jié)果不盡相同[10]。如柴毅等[10]研究表明Na+濃度為0.4%時，泥鰍的精子活力最強；而劉鑒毅等[11]研究表明Na+濃度為0.2%時，中華鱘的精子活力最強。該試驗結(jié)果表明，NaCl濃度為0.4 g/L時，藍曼龍的精子活力最強，激活率也最高。張濤等[12]研究證明了K+濃度為0.2%時，高體雅羅魚精子活力最強；而劉鑒毅等[11]研究表明K+濃度為0.05%時，中華鱘的精子活力最強。該試驗結(jié)果表明，KCl濃度為0.5 g/L時，藍曼龍精子活力最強，激活率也最高。說明Na+、K+對不同種魚類的最適調(diào)節(jié)濃度不同。

在魚類的精漿中，存在著以Na+、K+為主的多種離子，導(dǎo)致精漿是一個高滲透壓的環(huán)境，魚類精子在這個環(huán)境中的活動受到了抑制[7]。但是當精液排出到水中，精液中的各種離子就會被水稀釋，原本存在的抑制作用就會被減弱，精子被激活并開始運動。而一旦開始運動就會伴隨著大量能量的消耗，此時精子活力就會逐漸減弱[13]。一定濃度的NaCl或者KCl對精子活力的減弱有限制作用，可以達到延長精子運動時間和激烈運動時間的作用[14]。因此，要注意Na+和K+濃度對精子活力的影響。當藍曼龍精子活力達到最大后，再增加NaCl或是KCl濃度精子活力會逐漸降低。也就是說當外界激活液中離子的滲透壓大于精液的滲透壓，此時對精子的活動具有抑制作用。

3.2Ca2+、Mg2+對精子活力的影響在精漿的高滲透壓環(huán)境中，除了存在Na+、K+外，同樣存在Ca2+、Mg2+，但是試驗結(jié)果顯示，Ca2+、Mg2+對藍曼龍精子活力的激活作用大體上與Na+、K+相反，對藍曼龍精子的激活與活力存在明顯的抑制作用[7]。即使是低濃度的Ca2+和Mg2+都會對精子活力產(chǎn)生十分明顯的抑制作用，精子的快速運動時間和壽命同用純水激活相比都是驟然下降，激活率同樣如此。隨著Ca2+、Mg2+濃度的繼續(xù)升高，精子活力繼續(xù)快速下降，抑制作用不斷加大[15]。該試驗中，當MgCl2濃度高于0.3 g/L時，顯微鏡下的視野中只有約1/5的精子在緩慢游動，并且很快就全部不動了；當CaCl2濃度高于0.4 g/L時，視野內(nèi)幾乎沒有游動的精子，少數(shù)能動的精子也只是在原地顫動。這表明當CaCl2、MgCl2濃度過高時，其對藍曼龍精子活力存在極強的抑制作用。究其原因，很可能還是與滲透壓有關(guān)。CaCl2、MgCl2對藍龍曼精子激活和精子活力存在明顯的抑制作用。在配制激活液的時候，需盡量避免Ca2+、Mg2+濃度過高。

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