四氫嘧啶對熱變性凝乳酶復性作用的研究

武 彬，石天虹，劉雪蘭，閻佩佩，井慶川*

(1.山東省農業科學院家禽研究所，山東濟南 250023；2.山東職業學院生物工程系，山東濟南 250104)

凝乳酶是生產乳酪和干酪素必需的酶制劑，能水解牛奶中κ-酪蛋白的Phe105-Met106肽鍵使牛奶凝結[1]。凝乳酶與其他酶制劑一樣，易受多種物理化學因素的影響而變性失活[2]。以海藻糖為代表的糖類、多元醇、聚合物等化合物作為酶的穩定劑，具有適用范圍廣、作用效果較好的特點，已經得到了廣泛的應用[3]。四氫嘧啶(1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine)是一種滲透壓補償性溶質，與其他穩定劑相比，具有性質穩定、用量小、保護作用強等特點，是理想的酶保護劑[4-5]。筆者在研究四氫嘧啶對凝乳酶熱穩定性影響的過程中，發現添加四氫嘧啶的凝乳酶經過熱失活處理后，會發生顯著的復性作用，這與四氫嘧啶對植酸酶熱穩定性的影響完全不同[6]。

蛋白質的復性是變性蛋白質在適當條件下恢復其天然構象和生物活性的過程。蛋白質復性要求有一定的條件，如pH、溫度、離子強度、蛋白質濃度等。多種添加劑能促進蛋白質復性，包括：表面活性劑、低濃度變性劑、分子伴侶蛋白等[7]。目前，蛋白質從伸展態轉變為具有生理活性的天然態結構的復性過程與機理還沒有完全闡明。酶結構的變化是時間和溫度2個因素的復合作用所致[8]。筆者研究了四氫嘧啶存在條件下，熱處理時間、熱處理溫度和復性時間等因素對凝乳酶復性作用的影響。所獲結果有助于加深對部分失活的凝乳酶復性作用的了解，還可為熱穩定性研究中，部分失活態凝乳酶的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1材料Ectoine購自Sigma公司，純度>98%；凝乳酶，購自Sigma公司；脫脂奶粉購自伊利實業有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

1.2方法

1.2.1凝乳酶測定方法。凝乳酶活力測定采用Arima法[9]：適當稀釋凝乳酶0.5 mL，在35 ℃預熱5 min，加入到5 mL 35 ℃預熱的pH 6.0，含1%CaCl2的10%脫脂牛乳中，計時至管壁出現顆粒，記錄凝乳時間(T)。以35 ℃ 40 min凝乳1 mL牛乳的酶量為1個酶活力單位(1 U)，凝乳酶活力(A)的計算公式如下(其中n為凝乳酶的稀釋倍數，該文中均為1)：

(1)

1.2.2含四氫嘧啶的凝乳酶熱失活處理及酶活力測定方法。1.5 mL離心管中加入0.6 mL含有0.75 mmol/L四氫嘧啶的凝乳酶液，放入水浴鍋中立即開始計時，水浴完成后立即轉入冰水中快速降溫，然后取0.5 mL酶液測凝乳酶活力。

1.2.3凝乳酶復性測定方法。將熱失活處理后的凝乳酶轉入冰箱4 ℃靜置并計時，到復性時間后取出，水浴預熱至35 ℃，測定凝乳酶活力。

2 結果與分析

2.1復性時間對凝乳酶復性效果的影響蛋白質的復性需要一定時間，在較低溫度下，蛋白質分子空間結構的有序性會逐漸恢復。含四氫嘧啶的凝乳酶在68 ℃下熱處理一定時間，快速冷卻至4 ℃靜置冷藏，分別在0～42 h每6 h取樣測定凝乳酶殘余活力的變化情況，其結果如圖1所示。隨著復性時間的延長，凝乳酶的活力逐漸上升。熱失活處理1 min后立即測定，凝乳酶相對酶活力為61.5%；復性42 h后再次測定，酶活力則升至83.3%(相對酶活力提高21.8百分點)。另外，在能夠檢測到凝乳酶活力的熱處理時間也顯著延長。熱處理后立即測定，凝乳酶水浴6 min已無法檢測到酶活力(酶活力損失>93.3%)，而復性36 h和42 h后，熱處理12 min的凝乳酶均能檢測到8.8%的殘余酶活力。

圖1 相同復性時間下凝乳酶活力隨熱處理時間變化過程Fig.1 Change of rennet activity with heat treatment time at the same renaturation time

進行相同時間熱處理后，凝乳酶活力隨復性時間變化的結果能更清楚地反映凝乳酶復性的作用過程。熱處理1～7 min的酶活力隨復性時間變化的結果如圖2所示。熱處理時間越短，復性效果越好。隨著復性時間延長，凝乳酶活力上升的趨勢越來越平緩，36 h后凝乳酶活力基本保持穩定。因此，選定36 h為測定凝乳酶復性作用的最佳時間。

圖2中相對酶活力數據對復性時間求導，可得到復性反應的瞬時速率dU/dt。圖3所示為復性反應速率的時間過程

圖2 相同熱處理時間下凝乳酶活力隨復性時間的變化過程曲線Fig.2 Change curve of rennet activity with renaturation time at the same heat treatment time

曲線表面，大部分復性反應都發生在前24 h，24 h后復性反應速率逐漸降低。另外，熱處理時間越短，凝乳酶復性作用越明顯，熱處理1 min和2 min的凝乳酶復性反應速率顯著高于其他組。

圖3 不同熱處理時間凝乳酶復性反應速率的時間過程曲線Fig.3 Time curve of renaturation reaction rate of rennet at different heat treatment time

2.2熱處理溫度對凝乳酶復性效果的影響高溫下，凝乳酶分子震動加大，導致凝乳酶變性失活。熱處理時間相同時，不同溫度下蛋白質部分變性，肽鏈仍可保持一定的空間結構；在高溫下蛋白質發生不可逆變性，肽鏈伸展形成無規則的卷曲。凝乳酶在61、63、65、67、68、69和70 ℃下熱失活處理，復性前凝乳酶活力隨熱處理時間變化的情況見圖4。

圖4 含四氫嘧啶凝乳酶的熱失活時間過程曲線Fig.4 The inactivation time process containing four hydrogen pyrimidine chymosin thermal curve

將熱處理后的含四氫嘧啶的凝乳酶復性36 h，復性后凝乳酶隨熱處理時間變化的情況見圖5。

圖6為含四氫嘧啶凝乳酶在復性前后酶活力在不同溫度下的差值。在較高溫度和較短的熱處理時間下，凝乳酶復性效果最好，低于67 ℃，隨著熱處理時間的延長，凝乳酶復性作用逐漸降低。

圖5 含四氫嘧啶凝乳酶復性后酶活力隨熱處理時間變化的情況Fig.5 The change of enzyme activity with the time of heat treatment after renaturation of milk clotting enzyme containing four hydrogen pyrimidine

圖6 含四氫嘧啶凝乳酶復性前后相對酶活力的差值Fig.6 D-value of relative enzyme activity before and after renaturation of milk clotting enzyme containing four hydrogen pyrimidine

3 結論與討論

四氫嘧啶能和生物大分子發生相互作用，能夠改變分子界面和分子內部的氫鍵，增加β-折疊結構，并維持分子構象來提高其制劑熱穩定性[4，10]。然而，Meyer等[11]則發現，四氫嘧啶促進DNA雙螺旋結構的開環，降低了DNA的結構穩定性。研究也發現，加入四氫嘧啶后，凝乳酶分子熱穩定性下降，但凝乳酶熱失活后，存在顯著的復性作用。該試驗研究了熱失活處理的時間、溫度，以及熱處理后復性時間對含四氫嘧啶的凝乳酶復性作用的影響。結果表明，熱失活處理后，凝乳酶的復性主要發生在前24 h。在4 ℃靜置復性36 h后，凝乳酶活力基本不再升高，因此，將凝乳酶最佳復性時間確定為36 h。

四氫嘧啶存在下，熱失活處理的溫度對凝乳酶分子結構的作用不及熱失活處理的時間。在酶活力損失相近時，含四氫嘧啶的凝乳酶在較高溫度下(68～70 ℃)保溫較短時間(1～5 min)，凝乳酶復性所致的相對酶活力提升顯著高于在較低溫度下(61～65 ℃)長時間保溫(30～180 min)。該結果表明，雖然酶的熱失活是溫度和時間復合作用引起的，但二者對酶分子結構的影響并不相同，較長時間的熱失活處理比高溫對酶結構的破壞更加徹底。這可能是由于四氫嘧啶能夠促進凝乳酶二級結構的穩定性，在較高溫度下，熱處理時間較短時，凝乳酶二級結構的破壞程度較低，因此，凝乳酶分子更加容易復性；隨著熱處理時間的延長，二級結構逐漸破壞，導致能恢復催化活力的凝乳酶分子的比例越來越少。采用色譜學、光譜學與滴定量熱等手段有望進一步驗證上述猜想。

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