飼料和飼料原料中致瀉性大腸桿菌的檢測

李金磊，董 鵬，狄元冉，方忠意，張發旺，周紅霞，吳志明，高延玲

(河南省獸藥飼料監察所，河南鄭州 450008)

腹瀉病是導致發展中國家兒童發病和死亡的主要病因之一[1-2]。研究表明，致瀉性大腸桿菌(DiarrheagenicEscherichiacoli，DEC)是導致腹瀉的重要原因[3]。大腸桿菌是寄生于人體腸道和其他溫血動物體內的一種無害共生菌[4]。與人類疾病有關的大腸桿菌統稱為致瀉性大腸桿菌，根據臨床特征、流行病學和毒性特征可將致瀉性大腸桿菌分為6類：產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、典型和非典型腸致病性大腸桿菌(Typical and atypical enteropathogenicE.coli，tEPEC、aEPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli，EAEC)、腸黏附性大腸桿菌(Diffusely adherentE.coli，DAEC)和產志賀毒素的大腸桿菌(Shiga-toxin-producingE.coli，STEC)[5-6]。致瀉性大腸桿菌除了能引起急性發病和死亡外，還能導致嚴重的后遺癥，如出血性結腸炎(Hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)以及營養不良等[3,7]。

近年來，致瀉性大腸桿菌的感染越來越嚴重，對社會公共安全構成了極大威脅。2010年哥倫比亞的加勒比腹瀉兒童中，致瀉性大腸桿菌的檢出率為14.4%[8]，印度在5歲以下腹瀉兒童中的檢出率高達52.0%[9]，而加納在兒童和成人腹瀉病例中的檢出率分別為77.0%和38.0%[10]。2011年，德國致瀉性大腸桿菌疫情導致3 500多人感染，45人死亡[11]。2013年，我國對1 658份糞便拭子中致瀉性大腸桿菌進行檢則，總陽性率為8.93%[12]。

飼料及飼料原料作為畜牧業的初級投入品，其受到致病菌污染尤其是致瀉性大腸桿菌污染將直接影響畜產品質量，危害人類健康。筆者對2015—2016年飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌的檢出情況進行分析，以期引導飼料生產企業加強管理，提高產品質量。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株。EIEC CVCC1372、EPEC CVCC1396、ETEC CVCC195，均購自中國獸醫藥品監察所；菌株EHEC CICC21530購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2樣品。共抽取河南、遼寧、北京、浙江、廣東、黑龍江、內蒙古、江西濃縮飼料、配合飼料、動物原料、微生態制劑、酶制劑463批，具體抽樣情況見表1。

1.1.3試劑。營養肉湯、腸道增菌肉湯均購自北京路橋技術股份有限公司；5種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑購自北京卓誠惠生生物科技有限公司；Marker DL2000購自北京康為世紀生物科技有限公司；西班牙瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2儀器與設備低溫可疊放搖床MaxQ SHKE 600-8CE型(美國Thermo scientific公司)；梯度PCR儀LabCycle Standard Plus型(德國SENSO公司)；凝膠電泳成像系統GeiDov XR(美國Bio-Red);拍擊式均質器400m型(美國Interscience公司)；臺式高速冷凍離心機3-18K(德國Sigma公司)；電子天平PL2002型[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；高壓滅菌鍋HVE-50型(日本HIRAYAMA公司)。

1.3方法

1.3.1樣品采集。用一次性手套無菌采集飼料及飼料原料約300 g，裝于無菌自封袋內，4 ℃下保存，24 h內送回實驗室檢測。

1.3.2增菌。無菌稱取待檢樣品25 g，置于無菌均質袋中，加入225 mL營養肉湯，由均質器拍打1～2 min，(36±1)℃下培養6 h。挑取1環，接種于30 mL腸道增菌肉湯內，42 ℃下培養18 h。同時，設置陽性對照和陰性對照。

表1 2015—2016年飼料和飼料原料抽樣數量統計

1.3.3菌液DNA的提取。采用煮沸裂解法提取樣品DNA。取1 mL上述增菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL滅菌去離子水重懸，12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入100 μL滅菌去離子水重懸，于沸水中煮10 min后取出，12 000 r/min離心2 min。取上清作為PCR擴增模板。陽性對照和陰性對照均按照相同方法提取DNA。

1.3.4PCR擴增。采用致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測試劑盒進行PCR檢測。PCR反應體系如下：2×PCR Buffer 12.5 μL、10×Multiplex Assay(A211L)2.5 μL、25×PCR Enzyme 1.0 μL、Nuclease-free Water 7.0 μL、模板核酸樣品2.0 μL,總計25.0 μL。PCR反應程序如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 5 min。

1.3.5瓊脂糖凝膠電泳檢測。配制1.2%的瓊脂糖凝膠，且膠的長度不小于10 cm；電壓設置為10 V/cm；電泳時間為20～30 min。

1.3.6結果判定。若陽性對照有與設計長度一致的DNA電泳條帶，且陰性對照無條帶或無特定長度的DNA條帶，則試驗成立，否則試驗不成立；若樣品有與陽性對照一致的DNA電泳條帶，則判定為檢出致瀉性大腸桿菌。

2 結果與分析

2.1總體檢出情況2015—2016年共檢測飼料及飼料原料463批，檢出致瀉性大腸桿菌陽性樣品12批，陽性率2.6%。其中，EPEC陽性樣品7批，陽性率1.5%；ETEC陽性樣品3批，陽性率0.65%；EHEC陽性樣品2批，陽性率0.43%；未檢出EIEC陽性樣品。部分陽性樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。

注：M為Marker DL2000；P為4種致瀉性大腸桿菌陽性對照；S1、S2、S3為陽性樣品Note: M.Marker DL2000；P.positive control of 4 kinds of DEC; S1,S2,S3 were positive samples圖1 部分樣品4種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram for mutiple PCR results of 4 kinds of DEC in some samples

2.2各地區的檢出情況由表2可知，河南共檢測樣品225批，陽性樣品7批，陽性率3.1%；廣東共檢測樣品60批，陽性樣品2批，陽性率3.3%；北京共檢測樣品30批，陽性樣品1批，陽性率3.3%；遼寧共檢測樣品22批，陽性樣品2批，陽性率9.1%；浙江、黑龍江、內蒙古、江西未檢出致瀉性大腸桿菌陽性樣品。

2.3各類樣品的檢出情況由表3可知，共檢測96批酶制劑，其中陽性樣品8批，陽性率8.3%；動物原料138批，陽性樣品2批，陽性率1.4%；濃縮飼料34批，陽性樣品1批，陽性率2.9%；微生態制劑73批，陽性樣品1批，陽性率1.4%；配合飼料中未檢出陽性樣品。

表2 各地區致瀉性大腸桿菌檢出情況

3 結論與討論

近年來，致瀉性大腸桿菌感染給公共衛生帶來很大的威脅[5，13]。據估計，全球范圍內每年有超過10億腹瀉病例，導致約200萬人死亡，且腹瀉是導致低收入國家和中等收入國家青少年兒童疾病和死亡的重要病因，而致瀉性大腸桿菌是導致腹瀉的重要原因[14]。研究發現，致瀉性大腸桿菌在腸道致病菌中居于第3位，檢出率達5.2%，其中以EPEC為主[3]。致瀉性大腸桿菌很難像沙門氏菌或志賀氏菌一樣通過常規生化試驗加以區分，血清分型也不能很可靠地區分致瀉性大腸桿菌，因此對致瀉性大腸桿菌的檢測需要非常專業的試驗技術[15]。

表3 各類樣品中致瀉性大腸桿菌的檢測結果

筆者于2015—2016年對飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌進行檢測，從463批樣品中共檢出致瀉性大腸桿菌12批，檢出率為2.6%。其中，EPEC陽性樣品7批、ETEC陽性樣品3批，EHEC陽性樣品2批，陽性率分別為1.50%、0.65%和0.43%；從96批酶制劑中檢出陽性樣品8批，陽性率8.3%；從34批濃縮飼料中檢出陽性樣品1批，陽性率2.9%；從138批動物原料中檢出陽性樣品2批，陽性率1.4%；從73批微生態制劑中檢出陽性樣品1批，陽性率1.4%。這說明飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌污染比較嚴重，尤其是濃縮飼料和酶制劑。今后，飼料生產企業應加強對飼料及飼料原料的生產管理，從源頭做起，嚴把質量關，努力提高自檢自控能力，尤其是對濃縮飼料、酶制劑和動物原料的監測和控制。

應用多重PCR檢測技術，能夠快速、準確、高通量地檢測飼料及飼料原料中致瀉性大腸桿菌，對防止食源性疾病的危害，開展主動監測和危險性評估進而解除致瀉性大腸桿菌對人類的危害具有重要的意義。

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