牛胚胎回收和質量評價

蔡世芹

（黑龍江省林口縣畜牧獸醫局157699）

1 胚胎回收

牛胚胎大約在靜立發情后約第4天進入子宮，可在6～8d后回收胚胎，此時胚胎應處于桑葚胚或早期囊胚階段，胚胎周圍仍有透明帶包被。在回收胚胎之前，可采用直腸觸診法檢查超排反應效果，也可采用直腸內超聲掃描來評估，后一種方法能更加準確地估計黃體數量和未排卵的卵泡數，但難以估計黃體的準確數量，特別是當卵巢上有多個黃體存在時更為困難。如果只有一兩個黃體，或是有卵泡囊腫，建議不要回收。沖胚先對母牛進行硬膜外麻醉，以阻止努責和排糞。沖胚過程中，應對會陰部、陰唇內部進行清洗干凈，并用溫和的消毒劑仔細消毒，盡可能地減少污染非常重要。

最常用的采胚管是福利氏（Foley）橡膠導管，這種導管可經直腸小心控制，由子宮頸導入子宮角的理想位置，當導管尖部到達子宮角中部時，將氣囊中裝滿鹽水或空氣。應注意在插入導管及充滿氣囊過程中切勿損傷子宮內膜，否則會導致沖洗液回收不全或引起出血。如果出血，則隨后出現的血凝塊會干擾胚胎鑒定。在小母牛沖胚時可能有必要使用子宮頸開張器，應當注意開張器在進入最后一個子宮頸環后不要穿入子宮。

兩個子宮角可分別進行沖洗，或沖洗整個子宮體。常用的沖胚液一般為改良的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），添加1～2%的牛血清白蛋白（BSA）或者犢牛血清（FCS）及各種抗生素。為了防止胚胎黏附到過濾器、培養皿和導管上，沖胚液中應加入足夠的、沒有被病毒污染的蛋白質。有兩種沖胚方法，即連續沖胚法，或用30～50ml沖胚液的注射-抽吸式重復間斷式沖胚法。所需沖胚液的量在不同動物略有不同，每個子宮角約0.5L，經產牛用量大些。不論采用哪種方法都要回收所有注入的沖胚液，因為其中可能會有胚胎。

回收的沖胚液隨后轉入特殊設計的孔徑為70μm的濾器中，使體細胞（如紅細胞）和組織碎片通過，但能留下胚胎（直徑約150～200μm）。 然后將濾器中的物質再轉入有方格標記的皮氏培養皿中，同時用沖胚液反復洗滌濾器底部。采用漏斗或其他錐狀玻璃器皿用沉淀法收集胚胎，檢胚時，黏液和其他碎片可能會把胚胎包裹起來干擾操作。檢胚在立體顯微鏡50～100倍放大下進行，找到胚胎后將其轉入小的加有5～10%FCS的DPBS小培養皿中。

2 胚胎質量的評價

在不含血液和組織碎片的皮氏培養皿中對胚胎發育階段和質量進行評價。對胚胎形態學評估應按國際胚胎移植協會標準，評價胚胎所處的發育階段和胚胎質量。在第6～7天回收的受精卵中，大多數胚胎都處于致密桑葚胚、早期囊胚、囊胚或擴張囊胚階段。如果在發情后第8天前回收胚胎，則很少能見到孵化囊胚。致密桑葚胚至少應有16個細胞，單個卵裂球的表面應清晰。雖然在早期囊胚期囊胚腔小，但可區別內細胞團和滋養層細胞。當在培養皿中觀察時，胚胎可能會吸入一些液體，形成一個或小或大的囊胚腔，這是胚胎健康又質量高的標志。但體外生產的胚胎卻很少看到這樣的現象。胚胎質量一般評定為優質、良好、一般、較差4等，另外還需辨別出未受精的卵子（UFOs）。 要清晰地辨別出優質和良好的胚胎比較困難，因為它們都呈球形，卵裂球無退化應現象。質量屬于一般范疇的胚胎，有些卵裂球或許發生退化，位于滋養層細胞之外，不再參與胚胎形成。質量屬于較差范疇的胚胎，正常卵裂球數極少。未受精卵子可能會呈現不同的形狀，有時會出現退化現象，或者會包含有降解的分布不均勻的卵質。

體內產生的牛桑葚胚和囊胚活力很強，可保存在小皮氏培養皿（內有適量培養液）中，或是保存在人工授精用細管中，在室溫下保存24h而活力并不喪失。如果回收后在4℃條件下保存48h，也能得到令人滿意的妊娠率。此外，體內生產的胚胎對冷凍和玻璃化過程的耐受性也很強。

胚胎回收的結果有很大差異，因為它們取決于供體對超排的反應性。雖然如此，一般來說期望能得到如下結果，5%的供體由于對超排刺激的反應性很低而不能沖胚；20%的供體回收的胚胎不宜移植或沒育后力；每個供體胚胎或UFOs的總數為8～10個，其中約6個胚胎可以移植。