基因修飾ADSCs移植對(duì)皮瓣保護(hù)作用的研究進(jìn)展

吳玉偉 馬志兵 魏韓笑 沈才齊 金培生

皮瓣由血液供應(yīng)的皮膚及其附著的皮下組織所組成，皮瓣轉(zhuǎn)移到受區(qū)，與受區(qū)創(chuàng)面重新建立血液循環(huán)的過程為皮瓣轉(zhuǎn)移的全過程。皮瓣在形成與轉(zhuǎn)移過程中，最重要的是保證皮瓣成活，然而在整形外科實(shí)踐中卻常常發(fā)生皮瓣血循環(huán)障礙，導(dǎo)致皮瓣成活不良，甚至發(fā)生壞死。ADSCs一般都有很強(qiáng)的自我更新能力和多向分化潛能，主要位于機(jī)體脂肪組織中的一種間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），ADSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞中易于培養(yǎng)和可大量應(yīng)用的種子細(xì)胞，其作為細(xì)胞治療在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)方面的研究日益受到關(guān)注。ADSCs具有機(jī)體來源廣泛，取材方便，對(duì)供體損傷小的特點(diǎn)，而且在體外增殖和遷移能力較強(qiáng)，在特定條件下可分化形成多種終末細(xì)胞，經(jīng)多次傳代后仍可保持其遺傳性狀的穩(wěn)定，而且能穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染的外源性基因，分泌多種血管生成因子[1]，ADSCs已經(jīng)變成組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)炙手可熱的種子細(xì)胞[2]。ADSCs在低糖、低氧和低谷氨酸等條件下通常仍能保持活性。ADSCs具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力[3-4]，非自體移植時(shí)，機(jī)體可出現(xiàn)一定程度的免疫排斥，但這種較低免疫排斥不會(huì)完全抑制異種脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。近年研究表明，人ADSCs傳代以后表面組織相容性抗原的表達(dá)減少，并且與異體基因外周血單核細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，不刺激產(chǎn)生混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)體外環(huán)境下也不引起T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，抑制了免疫反應(yīng)[5]。研究證實(shí)，ADSCs還具有造血支持作用以及可被腺病毒等高度轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)，可作為基因轉(zhuǎn)移良好的靶細(xì)胞；ADSCs易于外源性基因?qū)耄勺鳛榛蛑委煹哪康幕蜉d體細(xì)胞，不管是腺病毒載體、質(zhì)粒載體還是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，均可攜帶目的基因轉(zhuǎn)染ADSCs，并且在體內(nèi)能夠高效地表達(dá)，而不影響其干細(xì)胞特性。

1 基因修飾增強(qiáng) ADSCs移植效率

基因修飾又稱之為基因增補(bǔ)，是指使用生物化學(xué)方法修改DNA序列，在宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入目的基因片段，或者將基因組中特定基因片段刪除，從而使宿主細(xì)胞基因型改變或原有基因型加強(qiáng)。單純脂肪干細(xì)胞移植會(huì)受諸多影響因素而造成移植后早期細(xì)胞的減少，使得其作用減弱，而基因修飾為脂肪干細(xì)胞充分發(fā)揮作用提供了一個(gè)新的契機(jī)。基因修飾脂肪干細(xì)胞有多種方法如：質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染、腺病毒轉(zhuǎn)染及腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染。對(duì)于自體干細(xì)胞歸巢過程被認(rèn)為分為三個(gè)步驟：動(dòng)員、運(yùn)行及定植，干細(xì)胞歸巢到損傷部位的確切機(jī)制尚未明了，其中SDF-1/CXCR4軸被認(rèn)為在干細(xì)胞歸巢動(dòng)員過程中起重要作用，有人發(fā)現(xiàn)抑制SDF-1降解、SDF-1預(yù)處理或者基因修飾增加SDF-1、CXCR4表達(dá)，均可促進(jìn)歸巢、增強(qiáng)干細(xì)胞療效[6-8]，除此之外MCP-1/CCR、HGF/c-Met與干細(xì)胞遷移、黏附相關(guān)。目前研究在干細(xì)胞跨越內(nèi)皮的遷移中，一些黏附分子如整合素、選擇素等與干細(xì)胞的定植密切相關(guān)，如整合素在干細(xì)胞表面的減少可明顯降低干細(xì)胞歸巢。一些細(xì)胞因子和生長因子被視為干細(xì)胞歸巢因子如 SDF-1、HGF、FGF-2、IGF-1、HMGB-1等促進(jìn)ADSCs歸巢，如IGF-1可通過SDF-1α發(fā)揮作用，過表達(dá)IGF-1可顯著增加干細(xì)胞動(dòng)員數(shù)量[9]，HMGB-1可促進(jìn)干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢[10]。可通過基因修飾與脂肪干細(xì)胞歸巢相關(guān)分子促進(jìn)ADSCs歸巢階段而提高移植效率。

2 基因修飾增強(qiáng)ADSCs旁分泌

研究顯示ADSCs具有分泌功能，可分泌多種不同的細(xì)胞因子[11-12]，作用于組織、器官發(fā)育過程，可發(fā)揮促血管形成、造血支持、抗凋亡、調(diào)節(jié)或控制免疫、促細(xì)胞增生等作用。ADSCs不但具有分化成多種組織細(xì)胞的潛能，而且能夠旁分泌細(xì)胞因子，改善局部微環(huán)境，動(dòng)員機(jī)體干細(xì)胞參與組織修復(fù)[13]。

目前關(guān)于ADSCs移植保護(hù)皮瓣研究中ADSCs促血管形成是最重要的保護(hù)機(jī)制，Pu等[14]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞治療及其分泌因子IL-6可有效增強(qiáng)I/R損傷后皮瓣恢復(fù)和血管生成，機(jī)制可能是ADSCs分泌的IL-6通過STAT3磷酸化，然后IL-6通過經(jīng)典的信號(hào)通路刺激血管生成，增強(qiáng)皮瓣I/R損傷后的恢復(fù)。Han等[15]發(fā)現(xiàn)ADSCs輔助治療可顯著提高靜脈缺血再灌注型皮瓣的成活率，其是通過降低炎癥反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)、保護(hù)血管而發(fā)揮重要作用。Reichenberger等[16]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞治療能顯著提高缺血后皮瓣存活率，而這種效應(yīng)伴隨著顯著的血管生成反應(yīng)和血液灌注改善。Hasdemir等[17]發(fā)現(xiàn)ADSCs注射到皮瓣的底部增加了輻射大鼠背部皮膚模型皮瓣的存活率，ADSCs具有提高放射后隨意皮瓣血供的潛力，這種積極作用的機(jī)制可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)后的血管新生和血管擴(kuò)張。值得注意的是，ADSCs在缺血、缺氧及炎性環(huán)境中更能促進(jìn)其旁分泌作用而發(fā)揮其保護(hù)作用，近來Zubkova等[18]在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用腫瘤壞死因子α（TNF-α）處理ADSCs，發(fā)現(xiàn)TNF-α可使ADSCs中促血管化因子（成纖維細(xì)胞生長因子2、VEGF、白細(xì)胞介素8、單核細(xì)胞趨化蛋白1、細(xì)胞間黏附分子1）mRNA表達(dá)增加，提示了炎性因子環(huán)境可促進(jìn)ADSCs發(fā)揮促血管化作用。Yue等[19]研究證實(shí)低氧預(yù)適應(yīng)增強(qiáng)了脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)的存活能力，脂肪干細(xì)胞聯(lián)合移植缺氧術(shù)前預(yù)處理可有效促進(jìn)缺血性皮瓣成活率，提高大鼠背部并行皮瓣模型血管新生。王白石等[20]發(fā)現(xiàn)預(yù)先向擬形成皮瓣組織注射ADSCs后，在一定程度上阻礙了皮瓣的成活，并沒有發(fā)揮ADSCs促血管新生的作用，移植前對(duì)ADSCs進(jìn)行炎性微環(huán)境預(yù)處理，預(yù)先活化ADSCs后其在促進(jìn)移植組織成活過程中發(fā)揮更大的作用。

ADSCs分泌的細(xì)胞因子中與創(chuàng)面愈合、血管重建密切相關(guān)細(xì)胞因子有多種，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、基質(zhì)衍生因子（SDF-1）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板源性生長因子（PDGF）等。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們通過病毒/非病毒載體將治療基因?qū)階DSCs，使得ADSCs分泌某些因子的能力大大增強(qiáng)，并利用干細(xì)胞遷移和歸巢的特性，使攜帶有特殊治療基因的細(xì)胞準(zhǔn)確定位創(chuàng)傷部位，通過治療基因在一段時(shí)間內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，合成并釋放需要的生物活性分子，產(chǎn)生治療作用，提高了治療的靶向性和效率。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）作為一種多功能性生長因子，具有高效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的生長及新生毛細(xì)血管形成的作用[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-bFGF可刺激皮瓣的血管新生，提高皮瓣的存活率[23-24]，其可能機(jī)制是兩者相互協(xié)同，即ADSCs促進(jìn)bFGF表達(dá)，反過來bFGF促ADSCs生長，從而可顯著提高皮瓣成活面積。劉丹等[25]同樣發(fā)現(xiàn)，bFGF促進(jìn)ADSCs增殖，具有協(xié)同作用，ADSCs-bFGF可高效地刺激大鼠背部自身對(duì)照帶蒂皮瓣血管新生，保護(hù)皮瓣。研究表明bFGF與受體結(jié)合后，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)其分泌纖溶酶原激活物并刺激膠原酶活性，在血管化過程中，起到明顯的促進(jìn)毛細(xì)血管基底膜降解的作用，使得新生血管侵入并融合，形成毛細(xì)血管網(wǎng)[26]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）被認(rèn)為是血管形成密切相關(guān)的最重要的細(xì)胞因子，可促進(jìn)內(nèi)皮系細(xì)胞的存活及血管新生的發(fā)生，可與肝素特異性地結(jié)合，在生理或病理狀態(tài)下均能發(fā)揮強(qiáng)烈的促進(jìn)血管新生的作用[27]。Xu等[28]發(fā)現(xiàn)在兔耳靜脈淤血皮瓣中原位ADSCs移植，可減輕皮瓣淤血，提高靜脈淤血皮瓣成活率，并且指出這種作用可能與ADSCs促VEGF分泌能力密切相關(guān)。雷永紅等[29]發(fā)現(xiàn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGFl65）基因轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞（rADSCs），ADSCs可作為載體細(xì)胞，將VEGF基因運(yùn)送到達(dá)皮瓣遠(yuǎn)端，并通過分泌VEGF而提高皮瓣成活面積。Traktuev等[30]將脂肪干細(xì)胞懸液與內(nèi)皮細(xì)胞混合，于小鼠皮膚缺損處皮下注射后發(fā)現(xiàn)皮膚損傷局部血運(yùn)增加顯著。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）是一種小分子量的趨化因子蛋白，可以提高包括ADSCs、EPCs等多種干細(xì)胞的旁分泌、增殖以及遷移能力，將SDF-1α和VEGF注射到小鼠皮下，SDF-1α表現(xiàn)出與VEGF相當(dāng)?shù)拇傥⒀苄纬傻哪芰ΑＭ瑫r(shí)，VEGF與SDF-1α之問還存在著相互作用，SDF-1α能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，而VEGF也能誘導(dǎo)SDF-1α的表達(dá)[31]。曹菁等[32]將人脂肪干細(xì)胞局部移植到隨意型皮瓣后，可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的表達(dá)，促進(jìn)皮瓣的血管新生。近期發(fā)現(xiàn)ADSCs可分化為內(nèi)皮細(xì)胞或EPCs[33]，且能釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞因子（HGF）、趨化間質(zhì)來源因子-1（SDF-1）等促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子[34-35]。

肝細(xì)胞生長因子（HGF）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種間質(zhì)細(xì)胞衍生多效性因子，參與胚胎發(fā)育、血管新生、創(chuàng)傷愈合和器官再生等生物學(xué)過程，具有高效的促血管生長作用，能促進(jìn)血管新生，有助于側(cè)支循環(huán)的建立，除了作用于肝細(xì)胞外，近來的研究，HGF還可以作用于多種細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓紅系造血前提細(xì)胞等，促進(jìn)其有絲分裂、遷移以及形態(tài)的發(fā)生，可以對(duì)多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的形成、維持、重塑起到重要的血管營養(yǎng)作用，能提高細(xì)胞抗凋亡的能力[36-37]。吳一杰[38]將腺病毒介導(dǎo)的HGF基因轉(zhuǎn)染后hADSCs，用于輔助人脂肪顆粒的移植，發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的HGF基因轉(zhuǎn)染hADSCs可在裸鼠體內(nèi)高表達(dá)HGF，能顯著促進(jìn)移植脂肪內(nèi)的血管新生作用，提高移植脂肪的存活率。

血小板源性生長因子（PDGF）在創(chuàng)傷愈合過程中可以誘導(dǎo)功能性血管形成，目前認(rèn)為血小板源性生長因子主要作用于血管形成后期，可以刺激成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移活動(dòng)。

多效生長因子基因（Ptn）是一個(gè)原癌基因，該基因目前已證實(shí)其能促進(jìn)血管形成，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移及刺激神經(jīng)突觸生長[39]，Ptn基因能轉(zhuǎn)染小鼠ADSCs并高表達(dá)PTN蛋白，為組織工程血管構(gòu)建種子細(xì)胞選擇提供了新思路，為缺血性病理損傷治療提供新手段。

3 基因修飾增強(qiáng)ADSCs移植后存活

目前研究通過對(duì)凋亡信號(hào)通路相關(guān)因子如利用p-Akt、Bcl-2、HO-1等因子過表達(dá)均可提高脂肪干細(xì)胞在移植區(qū)域的存活。Bcl-2抗凋亡蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中有著重要的作用，扮演著抑制細(xì)胞死亡的角色[40]。利用Bcl-2轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠提高移植后的存活率，也能夠增加VEGF的表達(dá)。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)能夠延緩脂肪干細(xì)胞的凋亡、增加脂肪干細(xì)胞旁分泌及促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的生長[41]。

4 展望

不可否認(rèn)近年來ADSCs移植治療方式具有無可替代的優(yōu)勢(shì)，但如何促進(jìn)ADSCs移植后的存活、遷移、歸巢，如何增強(qiáng)ADSCs抗感染、抗凋亡、抗缺血能力，對(duì)ADSCs移植促進(jìn)皮瓣成活的療效具有十分重要的意義。多因素影響ADSCs歸巢，多細(xì)胞分子及其受體參與該過程，對(duì)基因與信號(hào)分子的逐步研究可能是明確ADSCs歸巢機(jī)制的新的路徑，相信隨著細(xì)胞分子生物學(xué)等學(xué)科的不斷深入研究，隨著對(duì)相關(guān)細(xì)胞分子及其受體的了解有助于對(duì)其進(jìn)行基因修飾，從而更好地解決ADSCs移植中潛在問題，從而最大程度上充分發(fā)揮ADSCs修復(fù)作用。

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