骨細胞及干細胞分泌的外泌體在骨重塑中的作用

陳德龍 陳鵬 鄧章榮 姜山 王粵淇 王海彬

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

近年來，組織工程學應用于骨組織再生和修復方面顯示了巨大的前景，而成骨細胞、破骨細胞及干細胞在其中發揮著重要的作用。正常骨組織由骨細胞和骨基質共同組成，通過骨重塑來維持內穩態的平衡及自身結構的完整，其中成骨細胞(骨形成功能)和破骨細胞(骨吸收功能)之間的動態平衡是骨重塑過程中最關鍵的環節。2007年，Valadi等發現細胞分泌的外泌體中含有生物活性mRNAs、microRNAs(miRNAs)、脂質和蛋白質，這使得研究人員對外泌體的研究熱情激增。隨著研究的進展，科學家發現外泌體在細胞間通訊及局部微環境的調節中發揮著特殊作用，因此本文對成骨細胞、破骨細胞及干細胞分泌的外泌體在骨重塑中的作用作一綜述。

1 外泌體的內容與功能

1.1 形態與來源

外泌體是由細胞內吞系統的多泡體(multivesicular body，MVB) 與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，直徑為 30 ～100 nm 的細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)[1,2]。透射電子顯微鏡下外泌體呈扁平狀或球狀[3]，在蔗糖溶液中的密度為1.13 ～1.19 g/mL， 其密度與細胞來源相關，并隨蛋白含量而改變[4]。外泌體最早由Johnstone等[5]在研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程中發現。后來研究發現，不僅網織紅細胞能釋放這種小囊泡，幾乎所有類型的活細胞都能分泌，例如T細胞[6]、巨噬細胞[7]、肥大細胞[8]、內皮細胞[9]、施旺細胞[10]、神經細胞[11]、腫瘤細胞[12]等。

1.2 外泌體的內容

外泌體含有蛋白質和核酸，Valadi等在2007年發現外泌體中含有RNA。同時，外泌體中包含了多種多樣來源于其分泌細胞的成分，包括蛋白、脂質(lipids)、mRNAs和microRNAs(miRNAs)。多種細胞來源的exosomes內均包含mRNA和miRNA，并且諸多研究已證實它們在exosomes參與細胞之間信息傳遞的作用機制中確實起到重要作用。根據一個專門收錄與exosomes研究相關的數據庫 ExoCarta (http: //www．exocarta．org /) 中的信息，現已發現的exosomes相關蛋白質有41 860種，RNA的種類超過7540和有1 116種脂質分子[13]。外泌體的組成與細胞來源相關，不同種類的細胞外泌體的組成不盡相同[14]。外泌體蛋白質的組成與細胞類型和組織特征相關，已通過Western印跡、熒光激活細胞和電子顯微鏡進行了廣泛的分析。外泌體富含熱休克蛋白(HSP70，HSP90)[15]和膜聯蛋白(膜聯蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ和Ⅺ)，有助于膜運輸和融合[16]。外泌體也富含運輸蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合分子[17]以及與分泌細胞特定功能相關的幾種蛋白質[15]，如MHC II(抗原呈遞細胞分泌的)[18]和CD86(抗原呈遞細胞)[19]。此外，外泌體含有高濃度的跨膜4蛋白家族(CD9、CD63、CD81)和腫瘤易感基因101(TSG101)[20]。在體外研究發現，CD9和CD82能抑制腫瘤細胞遷移和侵襲[21]。

除了蛋白質，外泌體還含有脂質，DNA, mRNA, miRNA和lncRNA，參與細胞間信息交流[22]。MiRNAs是非編碼RNA(non-coding RNAs)家族中的重要一員，大約有17～24個核苷酸長度，通過與目標mRNA上的3’非翻譯區(3’UTR)結合來調控翻譯后的基因沉默，進而抑制相關基因的表達[23]。miRNAs 是外泌體中的主要小RNA，當其他細胞“吞入”這些含有 RNA 的外泌體后，mRNA可以在受體細胞中翻譯出相應的蛋白質，microRNA 通過降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯來調控蛋白質在目標細胞中的表達，而siRNA可以敲除受體細胞中的目標基因達到基因沉默的作用。這種運輸模式使外泌體中的miRNA可抵抗來自RNAase的降解作用[24]。外泌體第二主要RNA為lnRNAs(長非編碼RNA，>200 bp)，通過用基因組DNA退火或修飾組蛋白復合物干擾基因表達[25]。在微環境中，外泌體表現為介導RNA的載體并遞送其內容物和調節受體細胞蛋白的產生。

1.3 生物學功能與作用

外泌體為細胞間通訊的載體，并且在細胞之間轉輸脂質、核酸(mRNA和miRNA)和蛋白質，可以在受體細胞中引起生物學反應和表達內容物生物學效應[26]。外泌體和其他生物囊泡之間的主要特征之一是存在大量的核苷酸。外泌體miRNA在雙重脂質膜保護下可以避免RNA酶降解，保持其生物活性，并穩定存在于體液(血液，唾液，尿液)中[27-29]，可作為早期發現疾病的生物標志物。此外，外泌體通過無創的方式獲得，有利于臨床的推廣與運用。

近年來，越來越多地報道間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)分泌的外泌體作為主要的治療劑，但是，目前干細胞分泌的外泌體缺乏臨床運用的報道，卻在再生醫學中已經表現出未來的潛力。

2 外泌體與骨重塑

2.1 促進成骨及血管化

體細胞(間充質干細胞及骨細胞)來源的外泌體在骨重塑中起著重要的作用。Xu等[30]發現人骨髓間充質干細胞(hMSCs)分泌的外泌體miRNAs在骨重塑的過程中存在明顯表達差異(let-7 a，miR-135b，miR-148 a，miR-199b，miR-203，miR-218，miR-219，miR-299-5p和miR-302b)，從另一方面表明了干細胞調控骨重塑的機制。其中外泌體miR-196 a通過調控成骨基因ALP，OCN，OPN 和Runx2的表達促進成骨分化進而促進骨折愈合。而且，人臍帶來源間充干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells hUCMSCs)分泌的外泌體可以啟動hBMSCs的成骨分化，并且上調骨形成相關基因的表達，包括ALP，BMP2，OCN，Osterix，Col1α和Runx2[31]。更令人欣慰的是，外泌體還能促進生物材料的成骨作用[32]。Zhang等[33]報道外泌體通過PI3K/AKT通路增加β磷酸三鈣(β-TCP)的成骨誘導能力。不僅如此，外泌體還能促進血管生成進一步促進骨形成。人類誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)來源的間充干細胞分泌的外泌體能具有顯著促進血管生成的能力，進一步增加細胞的增殖能力、上調成骨相關基因OPN，RUNX-2和COL1 在基因和和蛋白水平的表達[34]。而且，在體內顱骨骨缺損大鼠模型中，hiPSC-MSC-Exos +β-TCP復合支架通過增強血管的新生達到促進顱骨缺損的骨再生[33]。

2.2 抑制骨形成

作為細胞間通訊的介質，外泌體在抑制骨形成中的作用表現為降低成骨細胞功能和促進破骨細胞活性兩方面。文獻報道[35]，骨質疏松患者的血清中，外泌體中MiR-214和ephrinA2水平呈高表達狀態，這有可能顯著抑制了成骨細胞活性加重病情；在骨性關節炎的病理變化中，炎癥細胞通過促進破骨細胞衍生的外泌體miR-214-3p的轉移，來抑制成骨細胞的功能，進一步促進關節下骨的侵蝕[36]。外泌體對破骨細胞的影響同樣受到廣泛重視。破骨細胞分泌的細胞外囊泡含有let-7e，miR-21，miR-155，miR-210，miR-223和miR-378[37]。MiR-223抑制核因子I-A(NFI-A)的表達并控制破骨細胞分化。 NFI-A水平的下調影響M-CSFR的表達，這對于破骨細胞分化和功能至關重要[38]。MiR-210通過抑制TGF-β /activin信號通路和靶向AcvR1b受體調節成骨細胞分化[39]。MiR-155，干擾素-β誘導的miRNA，通過靶向SOCS1和MITF兩個破骨細胞形成的基本調節因子，抑制破骨細胞分化[40]。在MSC成骨分化過程中，MiR-21表達會被TNF-α抑制，而阻斷TNF-α可以顯著增強miR-21的表達和增加骨形成，并且抑制了Spry1的表達，這是FGF和ERK-MAPK信號通路的負調節因子[41]。

3 總結

外泌體作為機體內普遍存在的納米級、扁平狀、雙層脂膜結構，廣泛參與細胞間的交流。成骨細胞、破骨細胞及干細胞分泌的外泌體在骨重塑過程的動態耦聯平衡起著至關重要的作用，可為臨床治療骨缺損、骨不連、骨質疏松等疾病和骨修復材料的設計提供新的方向。但目前外泌體的研究尚停留在體外試驗及動物實驗中，缺乏臨床運用的報道。隨著研究的深入，外泌體作為基因分子治療骨科疾病將會成為新的里程碑。