Runx2基因參與骨代謝相關通路的研究進展

陳偉健 晉大祥 謝煒星 溫龍飛 李鉞 任東成 丁金勇 詹曉歡 許偉鵬 黃永青

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

1 Runx2的介紹

Runx2稱為核心結合因子 a1或多瘤病毒增強子結合蛋白及急性骨髓性白血病因子 3，屬于 runt 結構域基因家族成員之一。目前人類發現該家族有三個成員，即Runx1、Runx2、Runx3。其中與骨代謝密切相關的是Runx2。Runx2 基因根據起始氨基酸序列的不同分為 3 種蛋白異構體，分別是 Cbfal/P56(I 型 Runx2)， Cbfal/P57(Ⅱ型 Runx2) 和Osf2/Cbfa1(Ⅲ型Runx2)。雖然它們的 3’端與 runt 結構域一樣，但 5’端即 N 端序列則不同，介導的轉錄調控也不同。Runx2 作為一種成骨分化特異性轉錄因子，能夠調控眾多基因的轉錄。Runx2 表達是間質細胞向成骨細胞譜系分化的必要和充分條件，成骨細胞早期分化主要受Runx2的轉錄表達調控，成骨細胞(osteoblast,OB) Runx2缺失，其分化完全被抑制，不發生骨膜成骨和軟骨內成骨。研究[1,2]認為，在成骨細胞分化的初期，Runx2基因觸發骨基質蛋白的形成，如I型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素和骨涎蛋白等，但同時又使成骨細胞維持在較早期階段而阻止其進一步分化，Runx2的作用是提供大量的未成熟OB。

2 Runx2在骨代謝相關作用信號轉導通路

骨髓間充質干細胞成骨分化是一個復雜的過程。第一，骨祖細胞分化為成骨前體細胞，形成成熟OB。成熟OB可以分泌各種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和礦化ECM。在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中，存在多種信號通路調控成骨分化過程[3]，其中Runx2是重要的成骨轉錄因素，在早期成骨分化起決定性作用并已成為其分化標志物。一些信號通路和細胞因子參與細胞分化，而成骨微環境也影響成骨分化。越來越多的研究發現Runx2參與這些通路，與之密切相關的信號通路有TGF-β/BMP信號通路、Notch信號通路及Wnt信號通路，Runx2在這些通路中充當一個連接點[4]。

2.1 Runx2與TGF-β/BMP信號通路

BMP是TGF-β家族的成員之一。這種從骨提取的細胞外因子是骨形態發生最早期的信號分子，其中與骨形成最密切相關的是BMP-2。BMP可通過增加OB分化標志酶-堿性磷酸酶的活化和骨鈣蛋白等基因的表達，誘導未分化的骨髓間充質干細胞分化成骨，并可促進OB成熟TGF-β/BMP信號通路包括I型和II型絲氨酸蘇氨酸激酶受體激活，從而磷酸化細胞內Smad蛋白[5]。BMP可通過內分泌和旁分泌方式誘導成骨。細胞外BMP可能與磷酸化受體(如BMPR-IA和BMPR-IB)來激活骨髓間充質干細胞下游細胞因子包括Smad1/5 /8，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，使信號通路激活。

這些途徑中，Smad1/5/8信號通路是一個典型的成骨相關通路。Smad1、Smad 5通過與I型和II型絲氨酸蘇氨酸激酶受體結合后直接磷酸化，接著與2個或1個R-Smad 和 1 個Smad 4 以異源三聚體或異源二聚體的形式形成Smads復合物，然后轉移到細胞核內。這種復合物可能與核內Runx2協作或單獨作用誘導成骨相關基因表達，調控骨髓間充質干細胞成骨分化[6]。Smads復合物可以識別并結合到Runx2在C端的Smad結合區域(Smad interacting domain，SMID)和核基質轉導信號結合位點(nuclear matrix targeting signal，NMTS)起作用，顯著增加Runx2的轉錄特異性，增加Runx2的轉錄表達[7]。Dai等[8]研究證實金雀異黃素可通BMP2/SMAD5/RUNX2通路促進成骨分化。Smad復合物也能激活JunB(Runx2上游因子)間接地激活Runx2的表達。該通路被Smad6、7負反饋調控，Smad6、7 從細胞核進入細胞質，與Ⅰ型受體結合，競爭性干擾Smad1/5/8募集和磷酸化，并同時抑制Smad復合物形成和活性。Smad6、7可與泛素化連接酶Smurf E3 相作用，使其結合到Ⅰ型受體，導致受體降解，終止信號傳導[9]。這些途徑都間接抑制Runx2表達。

MAPK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號通路則是一個非典型的BMP信號通路，MAPK通路主要包括 MAPK激酶激酶(MAP kinase ki-nase kinase,MKKK)、MAPK 激酶(MAP kinase kinase，MKK)和 MAPK，這三種激酶能依次激活，其中MAPK 由胞外信號調節激酶1 (extracellular signal-related kinase 1，ERK1)、ERK 2、p38 MAPK、JNK和 ERK5 等組成。 ERK和 p38 MAPK可促進Runx2磷酸化，誘導骨髓間充質干細胞成骨分化。在近年人和大鼠骨髓間充質細胞實驗中發現力學信號傳導可通過MAPK信號通路轉變成生物學信號，使Runx2磷酸化，促進成骨，進一步解釋力學刺激如何在增加骨密度和強度方面起重要的作用，Runx2 基因表達的增強更被認為是力學刺激在成骨細胞內作用的“終點”[1]。血管內皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-c，VEGF-C)對骨缺損修復具有潛在的治療價值。研究發現VEGF-C干預能顯著增加Runx2的表達，促進骨髓間充質干細胞礦化的。進一步研究知道，VEGF-C誘導骨髓間充質干細胞的VEGFR2和VEGFR3的磷酸化。此外，抑制ERK信號通路有效地抑制VEGF-C誘導Runx2表達。這些結果表明，VEGF-C是通過VEGFR2和VEGFR3介導，以及激活ERK信號通路促進Runx2表達，誘導骨髓間充質干細胞成骨的[10]。胰島素樣生長因子又稱生長調節素，能激活ERK1/2，進而激活MAPK通路，使Runx2 的活性增加，Runx2 mRNA表達明顯上調，對骨形成有很強的促進作用，但阻斷MAPK通路后，可完全阻斷對Runx2 的作用。越來越多的證據發現成骨細胞分泌大量的生長因子如成纖維細胞生長因子-2、類胰島素生長因子-1等可通過MAPK通路來調節Runx2的表達[11]。而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抑制成骨的機制也正是通過該通路。TNF-α/IL-1β在MAPK信號通路上可能結合并激活p38, ERK1/2和JNK1/2，抑制Runx2的表達，從而抑制成骨。Huang等[2]研究證實TNF-α/IL-1β可激活MAPK通路減少BMP-2誘導Runx2的表達，導致成骨分化抑制。

2.2 Runx2與Notch信號通路

Notch信號通路包括Notch配體(DSL 蛋白)，Notch受體，CSL-DNA 結合蛋白和Notch效應分子。Notch信號通路是一種保守的信號傳導通路，參與多種細胞過程。當Notch配體結合其受體，Notch信號通路被激活，Notch受體被酶切于細胞膜外，然后釋放出與Notch配體連接的胞外部分，隨后在γ-分泌酶作用下胞內段被酶切，形成可溶性的NICD(notch intracellular domain，NICD)轉移到細胞核，結合轉錄因子CSL，形成NICD/CSL轉錄激活復合物，然后激活下游靶基因主要以-HES家族成員為主，包括HES1，HES5，HEY1等，發揮相應轉錄反應[12]。Notch信號通路既能促進成骨分化也能抑制成骨分化。目前許多學者認為，Notch的成骨潛能可能會隨時間變化的，Notch信號通路在早期成骨分化階段可能起促進作用，而在后期成骨分化階段卻抑制成骨分化，以此來維持骨髓間充質干細胞未分化狀態，促進骨髓間充質干細胞增殖，增加干細胞池的細胞，提高其成骨潛能[13-14]。在Notch信號通路中，受體Notch-1和配體Jagged-1蛋白的表達增加，Notch信號通路被激活，進而促進Runx2表達增高，促進成骨分化。內源性甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是一種由甲狀旁腺分泌的多肽類激素， PTH 在骨形成中有重要作用。研究[15]發現PTH可提高骨髓間充質干細胞中Notch信號通路表達，通過Jagged1/Notch1通路，使Runx2表達增高，促進成骨細胞分化，增強成骨細胞功能。Notch信號通路介導抑制成骨分化時，HEY與HES的效應分子可結合到Runx2，并抑制其轉錄活性，抑制成骨分化。相反，Runx2 的N-末端結構域能與Notch1的N-末端結構域結合并使Notch1-IC-RBP-Jk復合物分離，抑制Notch1的轉錄反應，在成骨分化過程中作為Notch信號通路的一個抑制因子[16]。

2.3 Runx2和Wnt信號通路

Wnt家族屬于原癌基因，由至少19個保守的分泌糖蛋白組成。根據 Wnt 蛋白轉導信號的方式， Wnt 信號轉導途徑可分為經典 Wnt 信號通路和非經典的Wnt信號通路。在經典Wnt信號通路中，Wnt與Frizzled受體結合并募集LRP5/ 6受體，形成復合體促進 GSK-3β磷酸化，抑制細胞內糖原合成酶激酶β的活性，阻斷β-連環蛋白(β-catenin)降解，導致β-catenin積累。積累的β-catenin轉移到細胞核中，激活TCF/LEF轉錄。非經典Wnt信號通路則是獨立的β-catenin，磷脂酶C(phospholipase C, PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可能釋鈣進入細胞質發揮作用。Wnt信號通路具有強大的誘導成骨功能。Wnt3a和Wnt 10 a可激活經典Wnt信號通路，而Wnt4a和Wnt 5 a可激活非經典Wnt信號通路。這兩種途徑均可促進Runx2表達，促進成骨分化，抑制Wnt信號通路能抑制骨形成[17,18]。成纖維細胞生長因子 -2(Fibroblast growth factor-2，FGF-2)除了ERK信號通路，還能通過 PKC信號通路來激活Runx2和誘導其表達，因此被認為是Runx2的靶基因[19]。Cai等[20]研究發現Wnt /β-catenin信號通路能直接調節Runx2基因在高磷環境下表達促進血管平滑肌細胞成骨分化。Wnt信號通路對Runx2的不同影響可能與不同的細胞類型和不同分化階段相關。如OB在FGF-2長期作用下，其礦化被明顯抑制[21]。

綜上所述，Runx2能通過參與TGF-β/BMP信號通路、Notch信號通路及Wnt信號通路調節骨代謝，對骨代謝及骨重塑研究具有十分重要的意義。但Runx2的研究仍處于初級階段，對其精確的調節機制也未完全清楚，并且在多種骨代謝通路下發現參與調節骨代謝的Runx2在骨形成有促進作用也有抑制作用，具體機理也未完全清楚。探究Runx2在骨形成方面雙向調節的具體機理和影響因素，如何提高促進OB分化及避免抑制OB分化，是今后防治骨質疏松癥的藥物研究的一個方向和熱點。