兒童碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌流行病學分析及相關研究進展

田東興 ， 張 泓

碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）感染已成為臨床治療的一大難題。碳青霉烯類抗生素作為治療產 ESΒL及 AmpC酶等多重耐藥菌株感染的首選藥物，長期不合理使用加劇了CRE的耐藥性[1]。兒童作為一個特殊群體，可使用藥物有限，對于革蘭陰性多重耐藥菌感染的治療主要依賴于碳青霉烯類抗生素的大量使用，加之兒童自身免疫力低下，故其CRE檢出率不斷升高，尤其是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的檢出形勢較成人更加嚴峻[2]。因此，兒童中CRE的出現及流行將是抗生素治療及感染控制的一大難題。黏菌素作為目前治療CRE最有效藥物之一，質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1的發現使人類有可能再次陷入無抗菌藥物可用的危險時代。碳青霉烯類耐藥菌株引起成年人感染情況的報道比較多見，但是針對碳青霉烯類耐藥菌株造成的兒童感染流行及治療的報道較少。本文盡可能收集相關文獻就兒童CRE的流行現狀、耐藥機制、傳播及治療策略做一綜述。

1 CRE流行現狀

自20 世紀 80 年代，2株產 SME-1 的黏質沙雷菌在英國和美國被發現后，CRE的流行已遍布世界各地[3]，跨境旅行和醫療播散引起散發病例和小流行。地域氣候條件極其惡劣的冰島也已發現首例攜帶blaNDM-1基因CRE的感染[4]。腸桿菌科細菌作為臨床感染的重要病原菌，在我國CRE的流行情況同樣十分嚴峻。據2014年全國耐藥性監測網顯示，近10年，雖多重耐藥菌株（MDR）的分離率在下降，但CRE分離率在升高（2014年的分離率為3.9%），并且主要分布在兒科和ICU[5]。分離于兒童患者革蘭陰性菌的耐藥率總體呈上升趨勢，尤其是肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率逐年升高，2014年肺炎克雷伯菌對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為13.4%和12.6%，2016年分別為17.9%和15.4%，CRE和廣泛耐藥菌株（XDR）的檢出率也不斷增高[6]。在我國北京[7]、上海[8]、山東[9]、湖南[10]等地都出現兒童和新生兒CRE感染的報道，在兒童中CRE感染致死率較高，臨床上應引起足夠重視。

2 CRE耐藥機制

革蘭陰性菌對碳青霉烯類的耐藥機制，一是碳青霉烯酶（carbapenemases）的產生；二是膜孔蛋白缺失或改變合并AmpC酶或ESΒL酶的高表達以及外排泵。產碳青霉烯酶是兒童和成人中碳青霉烯類耐藥的主要原因。碳青霉烯酶根據其氨基酸序列同源性及作用機制的不同主要分為三類，A類酶包括最常見的KPC酶；Β類是金屬酶，最常見為 NDM酶；D類酶主要是目前世界范圍內暴發頻率越來越高的OXA-48酶。NDM、KPC和 OXA-48已廣泛分布于世界各地。KPC 多見于美國、希臘、以色列以及中國等，OXA-48 多見于北非、土耳其等國家，NDM多見于印度次大陸、巴爾干地區[1]。KPC 酶以KPC-2和KPC-3報道最頻繁，大多數分離自醫院的肺炎克雷伯菌。相比較而言，NDM和OXA-48更多存在于醫院和社區獲得性感染的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中。

世界范圍內最常見的碳青霉烯酶型為KPC酶，在新生兒中也已有少數報道，尤其是美國地區產KPC酶菌株在新生兒中近年由散發病例逐漸轉為多所醫院的普遍流行[11-13]。意大利作為KPC酶主要流行區，ST258型產KPC酶的肺炎克雷伯菌曾在意大利的一所醫院新生兒ICU內暴發流行[14]。KPC酶同時作為中國碳青霉烯酶主要流行型，在成人流行報道多見，而劉洋等[15]、姜梅杰等[16]也報道了產KPC-2酶肺炎克雷伯菌在兒童和新生兒中的流行情況。與成人產KPC酶菌株為主不同的是，根據近年相關文獻報道，兒童群體碳青霉烯類耐藥原因主要是產金屬酶（主要為NDM-1），產NDM-1酶菌株通常攜帶其他抗生素類耐藥基因，新型酶抑制劑阿維巴坦對其無效，在治療上更加棘手，預后更差。攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌在新生兒中暴發流行的報道越來越多[8，17-18]。委內瑞拉、哥倫比亞、美國、巴基斯坦、土耳其等均有產NDM-1菌株在新生兒和兒童的流行報道。KPC-2（ST11型）和NDM-19（ST20型）在上海一所醫院內同時發生暴發流行[8]，虞濤等[19]也發現產KPC-2和IMP-4的菌株在兒童中暴發流行的情況，針對產雙碳青霉烯酶菌株需要選擇針對性的治療方案。OXA-48 對青霉素類水解能力很強，對碳青霉烯類藥物敏感性較弱，不能被克拉維酸和他唑巴坦等抑制劑抑制，對超廣譜頭孢菌素類藥物敏感。Poirel等[20]報道的產OXA-48的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類高水平耐藥 （ MIC= 64 mg/L ）， 可能是由于該菌株blaOXA-48基因與IS1999聯合導致OXA-48的過度產生、以及36 kDa孔蛋白缺乏所致。有研究表明，OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在腸桿菌科細菌中播散[21]，最近OXA-48暴發流行報道越來越多，尤其是歐洲國家（如土耳其、西班牙、比利時），成為主要流行的碳青霉烯酶型，Adler等[22]報道了以色列一所醫院新生兒ICU中一次大規模產OXA-48酶菌株的暴發，共49例兒童患者證實或懷疑在新生兒ICU中感染或定植OXA-48菌株， OXA-48基因的易傳播性應引起全球各國家的高度重視。

針對碳青霉烯酶的檢測，2017年CLSI推薦改良碳青霉烯酶滅活法（modified-carbapenemase inactivation method，mCIM），其易操作，與Carba NP試驗和改良Hodge試驗相比敏感性和特異性更高，與PCR擴增碳青霉烯酶基因結果一致性更好。美國9個實驗室對mCIM實驗的對比評估，結果表明對碳青霉烯酶檢測的敏感度93%～100%（均值97%）、特異度97%～100%（均值99%）[23]。目前越來越多的研究運用全基因組測序進行流行病學調查研究，相對于應用廣泛的脈沖場凝膠電泳（PFGE）和多位點序列分型（MLST）而言，全基因組測序可以對病原菌毒力、耐藥性和流行性進行更全面的分析，分辨率更高，有助于鑒別暴發流行和散發感染的菌株，深入了解多重耐藥菌的傳播和暴發流行情況。

3 CRE的傳播

天然來源的碳青霉烯酶絕大多數以染色體介導為主，并且宿主特異性極高，使產該類酶細菌所致醫院感染的暴發流行較少見。而獲得性碳青霉烯酶（KPC酶等），其編碼基因位于質粒或其他可移動的遺傳元件上，易造成感染的暴發流行。

含耐藥基因的質粒可以在細菌間傳播，造成耐藥性的播散。最主要的是blaKPC型ST258相關的fiik復制子IncF質粒，第1例是2006年從以色列分離并被命名為pkpqil，這是一個113kb的質粒含有一個fiik2 Tn4401aIncF質粒復制子，pkpqil并不只局限于ST258 ，紐約一項調查發現其可出現在33%非ST258的肺炎克雷伯菌中，丟失pkpqil質粒的ST258限制了這些菌株的傳播能力[24]。耐藥性質粒可大致分為兩類：宿主范圍較窄的不相容組 F（incF，含不同復制子類型：FIA、 FIΒ 和FII） 和宿主范圍較廣的 IncA /C、 IncL /M 和 IncN。宿主范圍較廣的質粒可以在不同物種之間轉移，而宿主范圍窄的質粒往往被限制在同一物種甚至同一克隆菌株內[25]。Tn4401轉座子是最常見含blaKPC基因的移動元件。含blaKPC的IncFK5質粒pKp048在中國廣泛傳播并與肺炎克雷伯菌ST11密切相關[26]。

ST258作為世界流行的主要分型，因此了解ST258菌株的基因組背景對控制進一步播散具有重要的意義。ST258由clade I和 clade II組成，這兩個分支的區別在一個215 kb包含莢膜多糖的基因區域，莢膜多糖是肺炎克雷伯菌重要的毒力因子。ST258 clade II由 ST11 和 ST442 重組而成，而 ST258 clade I由 ST42 和 ST258 clade II重組而成[25]。ST258通常與產KPC和宿主范圍窄的IncF質粒相關，而ST11通常與產不同的碳青霉烯酶（KPC，VIM，IMP，NDM和OXA-48）及宿主范圍廣泛的質粒（IncF，IncA/C，InL/M，IncN）有關[26]。有研究使用第二代基因測序對一個ST258菌株進行質粒分析，發現這個菌株存在4個質粒共攜帶24種不同的耐藥基因[27]。另有數個研究也表明肺炎克雷伯ST258通常攜帶多種耐藥基因，如喹諾酮耐藥基因（oqxA和oqxΒ）、β內酰胺類耐藥基因（blaSHV-11，blaTEM-1）、氨基糖苷類耐藥基因[aac（6'）-Ib，aadA2和aph（3'）-Ia]、大環內酯類耐藥基因（mphA）、氯霉素耐藥基因（catA1）等[27-28]。ST258菌株可以減少膜孔蛋白的數量，這將導致菌株對抗菌藥物的高耐藥水平，使臨床治療進一步受限。德國最近的一項研究對肺炎克雷伯菌ST258暴發流行中有定植的患者隨訪中發現，仍有25%患者在長達1年后存在定植，甚至一些患者定植時間更久[29]。來自希臘的一項研究發現73%患者在攜帶blaKPC基因的ST258菌株平均9 d內暴露后可以發生腸道定植[30]。CRE定植患者有10%～30%概率發生感染，同時CRE定植者也是潛在播散者[31]。與大腸埃希菌群相比，肺炎克雷伯菌ST258主要存在于醫療設施相關的醫院感染，社區感染定植少見。ST258在全球的成功播散可能與其特異的莢膜多糖有關，clade I和 clade II莢膜多糖合成區域的不同可能是其逃避宿主防御的一種機制[25]。另有研究者推測含有ICEKp258.2基因簇的IV型菌毛系統可能與肺炎克雷伯菌ST258的高傳播性和高存活率有關。旅游和跨地區醫療行為與KPC的傳播密切相關。有報道稱母親為碳青酶烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的定植者可通過母嬰傳播到極低體重出生兒定植隨后發生感染，母嬰傳播也是極低出生體重兒發生CRKP定植的危險因素[32]，應常規對孕婦及嬰兒進行CRKP篩查，降低新生兒感染率和病死率。Runcharoen等[33]用全基因組測序的方法對環境（河水、土壤）和醫院中分離的肺炎克雷伯菌進行遺傳特征和毒力特性分析證實，環境和醫院中肺炎克雷伯菌起源高度相似僅存在毒力特性差異，結果表明，未經處理的醫院污水的釋放在環境中多重耐藥菌的出現及傳播中發揮作用，受污染的水用于灌溉時，就可能引起耐藥菌株在人類中傳播。

在兒童CRE感染因素分析中，使用免疫抑制劑、長期使用抗生素、住院時間延長為感染CRE的高危因素，其中抗生素長期使用與兒童CRE感染相關性最大[13]。長期廣譜抗生素的使用不利于腸道菌群的定植，導致菌群失調，而腸道菌群組成的改變已被證實可以導致新生兒壞死性結腸炎（NEC）、繼發感染等。改變腸道菌群，可以增加耐藥菌定植機會，促進感染播散。肺炎克雷伯菌參與宿主免疫反應并且決定其感染癥狀，MDR肺炎克雷伯菌的高病死率除與治療藥物缺乏外還可能與這些菌株引起強烈的免疫麻痹有關[34]，未來研究應更注重于MDR肺炎克雷伯菌對適應性免疫應答的影響。

4 CRE感染治療

根據國內外體外藥物敏感性試驗研究表明，針對CRE最有效的抗生素是多黏菌素、替加環素和磷霉素。尤其是多黏菌素和替加環素已被廣泛應用于CRE感染的治療[11]。然而最近對多黏菌素和替加環素耐藥日益增加，臨床上用磷霉素治療CRE感染的數據又非常有限，但是已知其容易產生選擇性耐藥[35]。部分氨基糖苷類如慶大霉素在體外對產KPC和VIM型的腸桿菌科細菌保持抗菌活性，但是大多數NDM型由于產生16sRNA甲基化酶對所有的氨基糖苷類抗生素耐藥。對于碳青霉烯類，大多數產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的MIC值升高，只有極少數菌株MIC值是低的。β內酰胺類和氨曲南雖不能被金屬酶水解但是抗菌活性低下，因為大多數產金屬酶菌株常伴有ESΒL[36]。多黏菌素和替加環素單藥用于CRE感染的治療效果差，時間殺菌試驗表明多黏菌素與其他抗生素如替加環素、碳青霉烯類的聯合應用對CRKP感染的治療表現出協同作用，并且可以抵抗CRE對磷霉素的選擇性耐藥[37]。值得注意的是人體內藥動學模型表明合適劑量碳青霉烯類單獨或者與替加環素聯合應用都可造成24～28 h內產KPC的肺炎克雷伯菌活性菌計數明顯的暫時降低[38]。但是，碳青霉烯類應用于CRE的治療時需滿足MIC≤8 mg/ L、與其他抗菌藥物如多黏菌素或替加環素聯合、大劑量延長輸注時間（3～4 h）[39]。

根據大量薈萃分析結果，目前普遍認為CRE感染聯合治療優于單藥治療，兒童治療可以借鑒成人治療的經驗但需要做藥物品種和劑量上的調整。替加環素由于其造成牙染色等不良反應不推薦用于兒童，氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物由于腎毒性、耳和軟骨毒性在兒童患者中應用也受到限制。有研究證實包括碳青霉烯類在內與多黏菌素或替加環素的聯合治療方案失敗率最低[40]。兒童治療雖缺乏相關研究，但有報道提示兒童使用多黏菌素其腎毒性和神經毒性發生率較成人低，認為多黏菌素在兒童中使用較為安全[41]，但是中國地區多黏菌素尚未被批準應用于臨床，故針對兒童CRE的感染，可根據藥敏結果權衡利弊選擇可行的治療方案，在使用抗生素的過程中密切監測其不良反應，使治療獲得最佳效果。

5 結論和展望

腸桿菌科細菌的碳青霉烯類耐藥問題一直備受關注，國內外均有CRE流行報道，近年兒童分離菌株對碳青霉烯類耐藥情況日益嚴重，其主要耐藥機制是產生碳青霉烯酶，以NDM酶多見，OXA-48有流行趨勢，應引起高度重視。更好地解決CRE感染帶來的難題，首先應當做到已有抗菌藥物的規范管理及合理使用；常規對孕婦及嬰兒進行CRKP篩查；再者就是新型抗菌藥物的研究和開發，針對世界廣泛流行的ST258菌株，有研究表明其特異的莢膜多糖可作為疫苗的一個很好的靶點[42]，專門研制針對含KPC酶肺炎克雷伯菌ST258的疫苗，有望降低ST258世界大流行趨勢。

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