槲皮素對胃癌細胞增殖及侵襲的調控作用及機制

耿 威 仉慧穎 李 林 陳 巖 邱一凡

(大慶油田總醫院消化內科，黑龍江 大慶 163001)

槲皮素是一種廣泛分布在水果、蔬菜及常見中草藥之中的天然黃酮類化合物〔1〕，可抑制膀胱癌、卵巢癌、結腸癌等多種惡性癌細胞增殖〔2～4〕，及肝癌、宮頸癌、乳腺癌等癌細胞的惡性侵襲〔5～7〕，其作為一種天然的抗腫瘤藥物，已得到廣泛的認可〔8〕。Caveolin(Cav)-1是一種位于人染色體7q31.2，編碼22 kD的小凹蛋白，是細胞膜表面小凹結構的主要成分，在癌癥治療中充當著腫瘤抑制因子的角色〔9〕。本文主要研究槲皮素對胃癌細胞增殖和侵襲的影響并探討其可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 槲皮素購置于美國Sigma 生物公司，用二甲基亞砜(DMSO)配成儲液，-20℃冰箱保存。RPMI-1640培養液來自美國Thermo 公司，胃癌細胞株(SGC-7901)來自上海生命科學院生物化學和細胞研究所；新生小牛血清來自杭州四季青生物公司，噻唑藍(MTT)試劑為上海碧云天生物公司產品，Transwell小室為美國康寧公司產品。全自動Western印跡實驗系統，購于美國 Bio-Rad 公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自Pierce公司，基底膜膠(Matrigel)購自BD公司，Cav-1 單克隆抗體購于Bioworld 公司。β-actin 鼠源性單克隆抗體購自 Sigma公司。

1.2細胞培養 將SGC-7901細胞置于37℃、5% CO2培養箱中貼壁培養，培養在RPMI-1640培養液(含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)中。待細胞至對數生長期后收集，調整細胞濃度為1×104個/ml，按每孔100 μl接種到96孔板中培養24 h。

1.3細胞增殖實驗 采用MTT比色法。將上述培養的細胞隨機分為5組，分別加入終濃度為20、40、60、80及100 μmol/ml的槲皮素，每組設置3個復孔，以不含槲皮素的細胞作為對照組，以空白孔調零，分別培養24、48、72 h，每孔加入MTT 100 μl作用4 h，加入DMSO 100 μl孵育30 min，在酶標儀570 nm處測吸光度A值，按公式計算細胞增殖抑制率：抑制率(%)=〔( A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)〕×100%。

1.4細胞侵襲實驗 采用Transwell小室法。分別用不含血清的 RPMI-1640培養基重懸實驗組及對照組細胞，制備單細胞懸液。將單細胞懸浮液調制濃度為約2×105個/ml，將各處理組細胞用胰酶消化并接種于25 μl Matrigel包被的Transwell小室中。上室加200 μl細胞懸液，下室加500 μl含10%血清的培養基作為趨化因子，培養24 h后取出小室，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，熒光顯微鏡下觀察并記錄，每孔隨機選取10個200倍視野，計數侵襲細胞數。

1.5Western印跡法檢測Cav-1蛋白的表達情況 將培養了24 h后的細胞分成3組，提取每組的蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并在含8%的脫脂牛奶的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(TBS)-吐溫(T)中室溫封閉2～4 h。孵育一抗，自封袋封閉4℃過夜，室溫下用TBS-T搖床洗膜：15 min ×1次和5 min×3次。孵育二抗，室溫下封閉1～2 h，室溫下用TBS-T搖床洗膜15 min ×1次和5 min×4次。加入化學發光液、顯影、定影，并保存膠片。將膠片進行掃描，用IPP6.0軟件測定印跡區帶的光密度值。以β-actin 為內參照，分析數據。蛋白表達強度=樣品中目的蛋白光密度值/相應β-actin 的光密度值。

1.6統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1槲皮素對胃癌細胞增殖能力的影響 隨著藥物濃度的遞增，24 h時，槲皮素對 SGC-7901的IC50為70.3 μmol/L；48 h時，IC50為41.6 μmol/L；72 h時，IC50為30.2 μmol/L。隨著槲皮素濃度的增加，其對胃癌細胞SGC-7901的抑制顯著增強(P<0.05)，且抑制能力隨時間的增加而顯著增大(P<0.05)。見表1。

表1 槲皮素作用 24、48、72 h對SGC-7901 的增殖抑制率

與同時間對照組比較：1)P<0.05；與同濃度24 h比較：2)P<0.05;與同濃度48 h比較：3)P<0.05；與同時間前一濃度比較：4)P<0.05

2.2槲皮素對胃癌細胞侵襲能力及Cav-1蛋白表達的影響 槲皮素各濃度組胃癌細胞侵襲數量與對照組比較明顯減少(P<0.05)，并且隨著槲皮素濃度的增大，胃癌細胞侵襲的細胞數量越來越少(P<0.05)。24 h后,槲皮素各濃度組Cav-1蛋白表達明顯低于對照組，且槲皮素的濃度越高，Cav-1 蛋白表達顯著降低。見表2，圖1。

表2 槲皮素對胃癌細胞侵襲數量及Cav-1蛋白表達的影響

與對照組比較：1)P<0.05;與前一濃度比較：2)P<0.05

圖1 各組Cav-1 蛋白表達情況

3 討 論

胃癌細胞的增殖、浸潤和轉移是大多數胃癌患者的死亡原因。抗腫瘤藥物槲皮素對胃癌的研究主要集中在對胃癌細胞增殖及機制的探討〔10，11〕，對胃癌細胞生長及凋亡的研究〔8，12，13〕，但是對胃癌細胞侵襲的研究較少〔14〕。本研究發現，胃癌細胞的增殖、侵襲能力和Cav-1的表達情況均與槲皮素的濃度呈現依賴性。

Cav-1為支架蛋白，直接作用于受體、激酶、黏附分子和 G-蛋白等信號分子，并可以控制亞細胞的分布和激活狀態。參與了小泡運輸、膽固醇動態平衡、大分子的內吞和調節信號轉導通路及細胞內鈣濃度等許多重要的細胞活動過程，Cav-1蛋白鏈N端的腳手架區域可通過識別特定的序列，與多種信號分子結合并調節其活性，如受體酪氨酸激酶等，影響多種信號轉導過程，進而參與了細胞的惡性轉化、增殖、侵襲等眾多惡性生物學行為。研究發現Cav-1的表達在不同腫瘤，同一腫瘤不同亞型或同一腫瘤發展的不同階段均是不同的〔9，15〕。

綜上，槲皮素可抑制胃癌細胞增殖和侵襲，其機制可能與Cav-1 蛋白的表達有關，然而，也有研究發現胃癌細胞的增殖與抑制端粒酶活性有關〔16〕，胃癌細胞侵襲與下調基質金屬蛋白酶(MMP)-2基因表達有關〔14〕，胃癌組織中Cav-1的低表達可能促進了胃癌的侵襲〔17〕。所以，槲皮素對胃癌細胞影響的具體內在作用機制值得深入研究。

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