氧化應激損傷對肺癌細胞凋亡的影響及機制

李偌銥 王 嫄 林 凱 朱美財

(中國人民解放軍空軍總醫院臨床檢驗中心，北京 100142)

細胞凋亡參與癌癥的全過程，并對癌癥的發生起負調控作用〔1，2〕。氧化應激反應可以導致細胞內Ca2+穩態失調，從而誘導細胞損傷，并參與癌癥的發生和發展〔3～5〕。Ca2+作為許多癌細胞凋亡的信號載體，對細胞的生存與凋亡有著重要的作用〔6〕。凋亡是由十分復雜的信號傳導通路所調控，目前已知的信號傳導通路有線粒體通路、死亡受體通路和內質網通路。Ca2+通過肌漿/內質網Ca2+ATP 酶(SERCA)從胞質中攝入，通過肌醇-1，4，5- 三磷酸受體(InsP3R)/Ca2+通道或RyR/Ca2+通道釋放，可見這些信號轉導通路都與Ca2+有密切關系〔7〕，但關于Ca2+如何激活凋亡調節因子的分子機制目前尚未闡明。本研究主要探討氧化應激對細胞內Ca2+的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 NCIH446細胞購自美國ATCC公司；過氧化氫(H2O2)購自北京化學試劑公司，臺盼藍購自Life technology公司；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒，購自Qiagen公司；PCR酶購自BIO-RAD公司；Counting cell Ⅱ (Thermo Fisher)；載玻片和蓋玻片購自日本公司；DPBS緩沖液、培養基1640胎牛血清購自GIBCO；雙抗購自Life technology；Flu4購自Thermo Fisher公司。

1.2細胞培養 NCIH446細胞培養于本實驗室，置于37℃,5%CO2,20%O2的CO2培養箱(Thermo Fisher)，1640培養基+10%胎牛血清+500 μl/L雙抗。

1.3處理方法 5×105的NCIH446細胞種于25 cm2的培養瓶中，當細胞貼壁培養24 h后，加入2、20、200 μmol/L H2O2處理4 h，以H2O2誘導NCIH446細胞，建立體外氧化應激損傷模型，以空白作為對照。

1.4細胞凋亡分析 取氧化應激處理細胞和對照細胞各10 μl，加入10 μl臺盼藍染液，充分混合，加入細胞計數板中，檢測總細胞數量和死細胞的數量，實驗重復3次，取其平均值。細胞凋亡率=死細胞/總細胞數×100%。

1.5細胞形態學的觀察 取氧化應激處理組和對照細胞，在Nikon倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化及細胞核的變化，放大40倍，同時用顯微鏡圖像采集系統采集圖像。

1.6激光共聚焦分析 以DPBS緩沖液清洗各處理細胞3次，Flu4終濃度為4 μmol/L，避光，37℃恒溫輕輕振蕩，孵育45 min，負載后的細胞以含0.2%牛血清白蛋白的DPBS緩沖液清洗2次，DPBS緩沖液清洗1次，以充分洗去細胞外未負載的殘余熒光染料；按上所述，向各實驗組細胞中加入相應的孵育緩沖液，室溫放置20 min，按實驗設計作相應檢測。以488 nm波長的激光作激發光在515 nm處探測熒光發射,選擇形態佳、貼壁好、在3～5 min保持熒光值穩定的細胞進行監測,選取15個細胞為1組，共選取3組，上述以測得熒光絕對強度代表Ca2+相對強度。每隔20 s掃描1次,直接監測單個NCIH446胞內游離Ca2+濃度。以Ziss LSM 710激光共聚焦顯微鏡系統進行成像，以ZEN 2011圖像處理軟件分析Ca2+的濃度。

1.7實時定量PCR 分析

1.7.1總RNA提取和cDNA的合成 收集處理后5×106的NCIH446細胞樣品，根據Qiagen試劑盒說明書提取總RNA，采用Qubit3定量總RNA，根據BIO-RAD試劑盒按步驟合成cDNA，合成cDNA的實驗條件為95℃ 10 min，60℃ 30 s，95℃ 60 s。

1.7.2mRNA引物的設計和合成 引物合成由中美泰和有限公司合成，引物序列：CACNA2D1正義：5′-ACTCCATATTCCCACCGACAT-3′，反義：5′-GCCAAAC ACCTGCCACAA-3′,長度133 bp;PI3K正義：5′-TTGCT GTTCGGTGCTTGG-3′,反義：5′-GACTTGCCTATTCAGG TGCTTC-3′,長度278 bp;PKC正義:5′-CGCTTCGCCCGCAAAGG-3′，反義:5′-GCAGGTGTCACATTTCATCCC-3′,長度351 bp;Bcl-2:正義:5′- TGTGTGTGGA GA GCGTCAAC-3′,反義:5′- GCCAGAGAAATCAAACAG AGG-3′,長度173 bp;ALK正義:5′-ACTCTCGCTGATCCTCTCTG-3′,反義:5′-TTGCTCAGCTTGTACTCAGG-3′,長度150 bp;KRAS正義:5′-GGAAGCAAGTAGTAATTGATGGA-3′,反義:5′-TTTATGGCAAATACACAAA GAAAG-3′，長度133 bp;BAX正義:5′-CTGACGGCAA CTTCAACTGG-3′,反義:5′-GTGAGGAGGCTTGAGGAG TC-3′,長度197 bp;β-actin正義：5′-CTTTGATTGCACATTGTTGT-3′,反義：5′-GAAGCAATGCTATCACCTC-3′,長度153 bp。

1.7.3實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR反應在Bio-Rad CFX connect 96實時定量PCR儀上進行，每個引物設6個復孔，反應體系為20 μl，包括上下游引物各1 μl，混合緩沖液5 μl,模板cDNA 1 μl，DDH2O 10 μl,反應程序為95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，共40個循環，數據采用CFX Manger 2.1進行分析。

1.8統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1肺癌細胞凋亡的變化 隨著外源性H2O2濃度的加大，細胞凋亡增多；20 μmol/L組(14.89%±6.34%)、200 μmol/L組(39.70%±12.30%)，與對照組(4.80%±2.62%)凋亡率比較有統計學差異(P<0.05)，但2 μmol/L組(5.40%±3.12%)與對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.2肺癌細胞結構的變化 肺癌細胞經200 μmol/L H2O2氧化應激處理4 h，細胞核出現核固縮現象，細胞出現接觸分離現象，細胞核出現部分小的碎片，而對照組細胞膜完整，細胞核形態正常，見圖1。

圖1 氧化應激對肺癌細胞形態的影響(×40)

2.3肺癌細胞中Ca2+濃度的變化 200 μmol/L組細胞內的Ca2+濃度(202.18±21.20)明顯高于對照組(32.20±18.02，P<0.05)。

2.4肺癌細胞中Ca2+相關因子mRNA水平的變化 200 μmol/L組PKC基因mRNA水平(1.90±0.32)、PI3K基因mRNA水平(1.70±0.26)、CACNA2D1基因mRNA水平(1.93±0.30)均顯著高于對照組(1.00)(P<0.05)。

2.5肺癌細胞凋亡相關因子mRNA水平的變化 200 μmol/L組ALK基因mRNA水平(2.01±0.22)、KARS基因mRNA水平(1.50±0.16)、BAX基因mRNA水平(2.61±0.40)、Bcl-2基因mRNA水平(0.60±0.13)與對照組(1.00)差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

在腫瘤細胞，活性氧(ROS)的來源可能是線粒體電子傳遞鏈，一氧化氮合酶(NOS)、NADPH 氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶/環氧和各種物質的氧化〔8〕。通常在生物體內存在的抗氧化系統能夠清除部分ROS，維持代謝平衡；在一些損傷因素的作用下，體內抵制ROS 的保護機制發生變化，誘導大量的自由基堆積，產生氧化和抗氧化的不平衡——氧化應激；氧化應激反應可以導致細胞內Ca2+穩態失調，從而誘導細胞損傷〔9〕。本實驗結果提示，氧化應激作用參與細胞的凋亡，與目前文獻的報道一致〔10,11〕。

本研究結果說明氧化應激作用加速細胞外Ca2+的內流。目前對于細胞內Ca2+濃度增高的原因有很多解釋。本研究從Ca2+的相關信號通道研究發現，外源性的氧化應激作用可以啟動PKC、PI3K和CACNA2D1因子表達升高，從而介導細胞膜和線粒體Ca2+通道開放，加速Ca2+內流和線粒體Ca2+釋放，造成細胞內Ca2+濃度增高，導致細胞內Ca2+重新分布。

研究證明，H2O2誘導細胞凋亡的機制包括激活死亡受體信號通路和線粒體信號通路〔11～13〕。本研究發現，氧化應激作用下，細胞內Ca2+濃度增高，肺癌細胞的ALK、KRAS和BAX凋亡相關基因的表達升高，但Bcl-2表達降低。在氧化應激的作用下，Ca2+濃度變化啟動了相關凋亡基因表達變化，當ALK、KRAS和BAX凋亡相關基因表達升高必然啟動細胞的凋亡。ALK和KRAS與腫瘤的發生發展密切相關，當腫瘤細胞內的ALK和KRAS的表達發生變化，參與腫瘤的發生和發展，當KRAS和ALK表達升高從而降低抗凋亡Bcl-2蛋白的表達，從而加速細胞的凋亡。促凋亡蛋白BAX轉位到線粒體膜上，促進線粒體內的凋亡蛋白釋放；抗凋亡Bcl-2蛋白在氧化應激的作用下表達降低，而促凋亡蛋白BAX表達升高，從而解釋了細胞凋亡的原因。

1Lim W,Yang C,Bazer FW,etal.Chrysophanol induces apoptosis of choriocarcinoma through regulation of ROS and the AKT and ERK1/2 pathways〔J〕.J Cell Physiol,2017;232(2):331-9.

2Chae IG,Kim DH,Kundu J,etal.Generation of ROS by CAY10598 leads to inactivation of STAT3 signaling and induction of apoptosis in human colon cancer HCT116 cells〔J〕.Free Radic Res,2014;48(11):1311-21.

3Davidson SM,Duchen MR.Calcium microdomains and oxidative stress〔J〕.Cell Calcium,2006;40(5-6):561-74.

4Tang TH,Chang CT,Wang HJ,etal.Oxidative stress disruption of receptor-mediated calcium signaling mechanisms〔J〕.J Biomed Sci,2013;20:48.

5Magenta A,Dellambra E,Ciarapica R,etal.Oxidative stress,microRNAs and cytosolic calcium homeostasis〔J〕.Cell Calcium,2016;60(3):207-17.

6Chang J,Yang JY,Choi J,etal.Calcium imaging in gentamicin ototoxicity:increased intracellular calcium relates to oxidative stress and late apoptosis〔J〕.Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2011;75(12):1616-22.

7Akpinar H,Naziroglu M,Ovey IS,etal.The neuroprotective action of dexmedetomidine on apoptosis,calcium entry and oxidative stress in cerebral ischemia-induced rats:contribution of TRPM2 and TRPV1 channels〔J〕.Sci Rep,2016;6:37196.

8Sheweita SA,Khoshhal KI.Calcium metabolism and oxidative stress in bone fractures:role of antioxidants〔J〕.Curr Drug Metab,2007;8(5):519-25.

9Simon HU,Haj-Yehia A,Levi-Schaffer F.Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction〔J〕.Apoptosis,2000;5(5):415-8.

10Yi B,Liu D,He M,etal.Role of the ROS/AMPK signaling pathway in tetramethylpyrazine-induced apoptosis in gastric cancer cells〔J〕.Oncol Lett,2013;6(2):583-9.

11Xu H,Li X,Ding W,etal.Deguelin induces the apoptosis of lung cancer cells through regulating a ROS driven Akt pathway〔J〕.Cancer Cell Int,2015;15:25.

12Wang T,Hou J,Su C,etal.Hyaluronic acid-coated chitosan nanoparticles induce ROS-mediated tumor cell apoptosis and enhance antitumor efficiency by targeted drug delivery via CD44〔J〕.J Nanobiotechnol,2017;15(1):7.

13Shim JH,Gim H,Lee S,etal.Inductions of Caspase-,MAPK- and ROS-dependent apoptosis and chemotherapeutic effects caused by an ethanol extract of scutellaria barbata D.Don in human gastric adenocarcinom cells〔J〕.J Pharmacopuncture,2016;19(2):129-36.