鼻咽癌篩查中三種EB病毒抗體檢測的應用價值分析

付 麗，李延忠

（1.山東電力中心醫院耳鼻喉科，山東 濟南 250000；2.山東大學齊魯醫院，山東 濟南 250000）

鼻咽癌（carcinoma of nasopharynx，NPC）為臨床常見惡性腫瘤，來源于上皮細胞，其發病位置主要有鼻咽腔側壁與鼻咽腔頂部。本病屬于全球性惡性腫瘤，但在北美、東南亞等地高發，同樣也是我國江蘇、廣西、廣東、湖南、香港及福建等沿海地區高發腫瘤[1]。本病作為頭頸部惡性腫瘤轉移率與侵襲性最高，早期無典型癥狀，確診后多為晚期，有較差的預后，目前治療以放射為主，輔助化療，一般不手術，而晚期鼻咽癌患者存活率僅14%[2]，療效差，因此臨床提出預防與治療鼻咽癌的關鍵在于篩查與早期診斷鼻咽癌高發地區人群，可提升NPC患者存活率。當前臨床已經明確NPC發生發展密切關聯于EB病毒（（Epstein Barr，EBV），其屬于皰疹病毒科，為臨床認識較早的關聯于腫瘤的病毒，外國學者首次于1966年發現其密切關聯于NPC。研究稱EBV完整病毒可導致機體鼻咽黏膜上皮細胞癌變，而在鼻咽癌細胞中不僅EB病毒基因組存在，而且還包括多類EB病毒特異性抗原[3]。近年來分子生物學技術逐漸發展，臨床基于分子水平角度不斷探討研究鼻咽癌與EBV間存在的關聯，且提出檢測NPC患者血清EBV抗體水平可有效篩查與診斷NPC。以往臨床多采用IE與間接免疫熒光法（IIF）檢測EA與VCAIgA抗體，步驟繁瑣，主觀因素影響較大，缺乏標準化與自動化，難以開展質量控制，因此臨床逐漸采用ELISA定量方法檢測EBV相關抗體。現詳述檢測Rta/IgG抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體對篩查NPC的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月～2017年1月齊魯醫院門診收治的鼻咽癌患者14例，均經鼻咽活檢病理檢查確診，尚未接受治療，設為鼻咽癌組，其中男性12例，女性2例，年齡為24～75歲，平均年齡為（43.8±8.5）歲。選取同期于我院門診就診的非鼻咽癌但表現出鼻咽部癥狀的患者320例，設為非鼻咽癌組，有鼻咽部癥狀的其他鼻咽部疾病如鼻炎、鼻竇炎、慢性咽炎、中耳炎、耳鳴、鼻出血等，排除頭頸部其他惡性腫瘤。其中男性214例，女性106例，年齡為18～78歲，平均年齡為（41.6±7.6）歲。選取同期于我院體檢的健康人500例設為健康組，其中男性342例，女性158例，年齡為18～72歲，平均年齡為（40.6±6.9）歲。

1.2 檢測方法

于清晨空腹狀態下采集3組研究對象靜脈血4～5 mL，常規放置30 min，血液凝固后開展離心處理，3000 r/min為離心速度，持續10 min，在-20℃冰箱中保存上層血液后待檢。應用酶聯免疫吸附劑試劑盒（來自北京同昕生物技術有限公司），應用酶聯免疫吸附試驗（EILSA）檢測Rta/IgG抗體，應用EILSA試劑盒（來自德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司）檢測EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體，嚴格按照試劑規定要求開展操作，陽性判定標準：S/CO值在1.0及其以上代表Rta/IgG陽性，S/CO值在1.1及其以上代表EA/IgA及VCA/IgA陽性。同時檢測EBV DNA：將乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血血漿分離出來，采用北京天根生化科技有限公司生產的DNA提取試劑盒。EBV DNA檢測方法為熒光定量聚合酶鏈反應法（PCR），將病毒拷貝數計算出來，用湖南圣湘生物科技有限公司生產的檢測試劑盒，陽性標準為EBV DNA計數在50 copy/mL以上，低于該檢測值則判定為陰性。

1.3 統計學方法

統計學處理軟件為SPSS 20.0，資料表示用n（%），卡方檢驗處理組間陽性率比較，若P＜0.05提示比較有顯著性差異。

2 結 果

2.1 3組研究對象血清EB病毒Rta/IgG抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體陽性率比較

鼻咽癌組Rta/IgG、EA/IgA及VCA/IgA抗體檢測陽性率均明顯高于非鼻咽癌組與健康組；非鼻咽癌組VCA/IgA抗體檢測陽性率明顯高于健康組；鼻咽癌組內VCA/IgA抗體檢測陽性率明顯高于EA/IgA與Rta/IgG抗體；非鼻咽癌組EA/IgA檢測陽性率明顯低于Rta/IgG、VCA/IgA；健康組EA/IgA檢測陽性率低于Rta/IgG與VCA/IgA，比較均有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

表1 3組研究對象血清EB病毒EBNAI/IgA抗體、EA/IgA抗體及VCA/IgA抗體陽性率比較 [n（%）]

2.2 3種EB病毒抗體篩查檢測鼻咽癌的臨床價值比較

VCA/IgA抗體檢測靈敏度明顯高于EA/IgA、Rta/IgG，Rta/IgG也高于EA/IgA；EA/IgA抗體特異度與陽性預測值明顯高于Rta/IgG、VCA/IgA，比較均有顯著性差異（P＜0.05），見表2。

表2 3種EB病毒抗體篩查檢測鼻咽癌的臨床價值比較（n，%）

3 討 論

NPC為我國發生率較高的惡性腫瘤之一，據統計全球NPC案例中我國占比高達80%，且男性患者數量比女性高2～3倍[4]。當前臨床尚未明確NPC發生機制，多認為關聯于遺傳因素、病毒因素及環境因素。遺傳因素主要為異常的白蛋白抗原基因，世界衛生組織證實人類腫瘤中70%～80%關聯于環境因素[5]，而體外實驗結果表明香煙煙霧提取物可加快EBV復制，吸煙會增加鼻咽癌發生風險，且在健康男性中參與激活EBV環節。病毒因素主要為EBV，臨床大量研究結果證實機體早期感染EBV或長期反復感染會致使鼻咽部上皮永生化并加快其惡化進程。EBV病毒屬于嗜B細胞，為皰疹病毒之一，為多種疾病誘發因素，累及多個臟器、系統如消化道、血液及呼吸等，研究稱EBV裂解感染狀態關聯于乳腺癌、食管癌及胃癌發生發展。

人類自然感染中EB十分普遍，水平傳播，可在被感染宿主體內終身潛伏，EB病毒可通過口口方式進行轉播，所以在人類群體中隱性感染者以及攜帶有EB病毒的無癥狀者是最為主要的傳染源[6]。兒童期多為原發性感染時期，主要為隱性感染，咽部上皮細胞為常見感染部位，上皮B淋巴細胞被EBV侵襲后沿著淋巴系統攜帶病毒進入血液循環中，且將病毒性抗原釋放出來，T淋巴細胞將抗原分子識別出后將其標志EBV-淋巴細胞破壞，但與此同時咽部上皮又會出現新感染EBV-B淋巴細胞，宿主被反復感染后EBV攜帶狀態得以維持。有學者提出B淋巴細胞主要介導EBV的原發性感染及病毒持續狀態[7]。細胞被EBV感染后若釋放病毒為產病毒性感染，反之為非產病毒性感染，后者有兩種形式，即潛伏性感染與惡性轉化，潛伏性感染主要經過如下過程：細胞內有整個病毒基因組潛伏，經由DNA多聚酶保留復制于早s期；基因組表達形式并非整體，而是基因有限部分；基因組激活關鍵在于表達BRLF1與BLIF1基因[8]。當前臨床提出NPC患者感染EBV的主要機制為受體學說，即EB病毒經由受體pIgR或CR2介導進入細胞[9]。在EB病毒抗體陽性與正常鼻咽上皮細胞鼻咽活檢組織中均無EB病毒，而在鼻咽原位癌中有單克隆病毒基因組出現，由此推測惡性細胞克隆擴展前EB病毒感染已經發生。

鼻咽癌治療效果取決于早期的檢測，而EBV血清學的篩查能夠有效明確鼻咽癌的高危人群[10]。羅耀凌等人臨床研究中，疾病對照組的病毒Rta-IgG與EAIgA以及DNA的陽性率和健康對照組的之間數據比較無顯著差異，這一結果表明了鼻咽癌在確診之前患者的血清中便存在高滴度各類型EBV抗體、抗原，因此對EBV相關抗原抗體進行檢測對于鼻咽癌患者血清學診斷具有重大意義[11]。以往臨床檢測EBV抗體的金標準為IIF，但需使用熒光顯微鏡，使用受限。而后曾毅于1982年用IE法檢測VCA-IgA，臨床逐漸將其作為常規方法，但其操作仍然比較繁瑣，且主觀影響因素較多；而ELISA操作簡易，客觀性高，重復性好，因此被臨床廣泛使用。在EBV抗體中VCA為病毒結構蛋白，合成于增殖周期，有較強的免疫抗原性。研究稱絕大多數NPC患者血清為VCA IgA陽性[12]，因此國內將其作為篩查與診斷NPC的常規手段，可提升NPC早期診斷率。本組結果表明VAC-IgA檢測NPC的靈敏度為92.9%，特異性為89.6%，準確度為90.1%。該抗體靈敏度較高可能導致部分假陽性，加大臨床工作量，而陽性患者中90%一生中可能無NPC患病風險，因此確診或排除陽性患者還需開展大量工作，防止受檢者承受巨大心理與精神壓力，經常復查也會增加其經濟負擔[13]。但盡管VCA有上述弊端，臨床還是將其作為篩查NPC的經典指標。

裂解復制期EBV會表達EA，有局限型與彌漫型兩種，其發生代表體內開始EBV復制[14-15]。本組EAIgA抗體檢測靈敏度為50.0%，特異性為99.9%，準確度為97.1%，，由此可知其靈敏度低，在其他腫瘤與正常人體內幾乎不會被檢出，NPC患者抗體滴度低于1.5時也難以顯示陽性，因此部分患者可能漏診，這是其最大弊端。因此臨床在診斷NPC或篩查高危人群時多聯合EA與VCA，兩種均為陽性多數可確診。RTA蛋白為EBV從潛伏期向裂解期轉變的關鍵調控因子，可相繼表達系列裂解早期基因，最終將EBV裂解干擾誘發。研究稱在不同人群中Rta/IgG均有所表達，但程度不一，如鼻咽癌組陽性率為81.3%，肝癌組為10.5%，胃癌組為10.5%，肺癌組為10.5%，乳腺癌組為20.7%，宮頸癌組為15.8%[16]，由此可知鼻咽癌組最高，因此在篩查NPC患者中使用Rta/IgG抗體檢測效果較好，可對鼻咽癌癌變發生最早時刻予以捕捉，有較高的特異性，為臨床篩查鼻咽癌的首選方式。本組結果表明Rta/IgG檢測NPC的靈敏度為85.7%，特異性為93.3%，準確度為92.7%。當前臨床認為Rta/IgG表達無關于NPC臨床分期[17]，但尚未明確其表達與NPC發生發展、轉移及浸潤關系，需臨床深入探討[18]。

綜上所述，Rta準確度、靈敏度及特異度均較高，VCA靈敏度、特異度較高，EA特異度高但靈敏度較低，相比而言VCA、Rta篩查NCP臨床價值較高，可結合實際選擇聯合檢測法，避免漏診。

[1]李仕偉,林艷麗,瞿 衛,等.探討EB病毒抗體對鼻咽癌篩查和療效的臨床價值[J].標記免疫分析與臨床,2016,23(1):113-114.

[2]張曉琍,周建林,曹穎平,等.鼻咽癌篩查中三種EB病毒抗體檢測的應用[J].中華檢驗醫學雜志,2015,38(2):111-114.

[3]邱厚匡,姚亞超,李 磊,等.EB病毒抗體及其DNA聯合檢測在鼻咽癌篩查和早期診斷中的價值[J].檢驗醫學與臨床,2015,8(10):1339-1341,1344.

[4]潘繼釗,黃海深,朱苑霞,等.探討三種EB病毒抗體檢測在鼻咽癌篩查中的臨床價值[J].中國醫藥科學,2016,6(19):225-228.

[5]李曉華,蒙以良,趙麗娟,等.壯族鼻咽癌患者EB病毒抗體與年齡的關系[J].中國老年學雜志,2014,17(10):2680-2682.

[6]吳尚文.血清EB病毒抗體檢測在鼻咽癌臨床診斷中的應用[J].河南外科學雜志,2013,19(2):93-94.

[7]鄧卓霞,翁敬錦,司勇鋒,等.廣西鼻咽癌高發區人群初篩后2年隨訪結果分析[J].廣西醫學,2016,38(4):517-520.

[8]鄭鳳嬌,傅泳航,陳文思,等.EB病毒重組抗原Rta蛋白的表達及用于鼻咽癌篩查ELISA方法的建立[J].解放軍預防醫學雜志,2016,34(4):464-467.

[9]陳裕鋒.鼻咽癌高危人群中鼻咽拭子EB病毒DNA定量檢測及其在鼻咽癌篩查中的應用[D].廣西醫科大學,2015.

[10]Ji Ming-fang,Yu Yuan-long,Cheng Wei-ming,Zong Yongsheng,Ng Park Sze-park,Chua Daniel Tsin-tien,Ng Munhon.Detection of Stage I nasopharyngeal carcinoma by serologic screening and clinical examination.[J].Chinese Journal of Cancer,2011,30(2):.

[11]羅耀凌,陳 浩,彭頌國,等.聯合檢測EB病毒不同抗體及EB病毒DNA在鼻咽癌血清學診斷中的價值[J].中華醫學雜志,2013,93(44):3516-3519.

[12]王盼盼,季明芳,吳標華,等.鼻咽癌高發區人群患鼻咽癌風險率的動態觀察[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(15):1144-1147.

[13]陳善昌,吳家恩,陳 棟,等.17175例體檢人群中EB病毒抗體陽性結果分析[J].中國基層醫藥,2016,23(11):1653-1655.

[14]鄧卓霞,王勇利,杜海軍,等.廣西地區三類人群EB病毒潛伏膜蛋白2特異性細胞免疫狀態的研究[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2016,30(2):194-198.

[15]杜 云,俞 霞,季明芳,等.EB病毒血清抗體水平與鼻咽癌臨床分期相關性研究進展[J].中國腫瘤臨床,2016,43(19):869-872.

[16]連仕鋒,季明芳,吳標華,等.EB病毒血清學篩查鼻咽癌高、中危人群的隨訪研究[J].中華預防醫學雜志,2015,49(1):26-30.

[17]王盼盼.鼻咽癌血清學篩查研究進展[J].腫瘤研究與臨床,2013,25(8):572-574.

[18]Ho Ching-Yin,Chan Kee-Tak,Chu Pen-Yuan.Comparison of narrow-band imaging and conventional nasopharyngoscopy for the screening of unaffected members of families with nasopharyngeal carcinoma.[J].European Archives of Oto-Rhino-Laryngology,2013.