I—TAC及其受體CXCR3在乳腺癌組織中的表達及其意義

劉江濤 李亭亭 王振波

【摘 要】 目的 檢測I-TAC及其受體CXCR3在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達差異，探討I-TAC/CXCR3生物軸在乳腺癌發生、發展過程中的作用。方法 收集濱州醫學院附屬濱州市中心醫院普外科經手術切除的40例乳腺癌組織作為實驗組，同時收集相應的40例癌旁正常乳腺組織作為對照組。逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組織化學技術分別檢測各組織I-TAC及CXCR3 在mRNA及蛋白水平的表達差異，并分析CXCR3的表達與乳腺癌常見臨床病理參數的關系。結果 I-TAC及CXCR3在乳腺癌組織中mRNA水平和蛋白水平的表達均顯著高于癌旁乳腺組織，差異分別均具有統計學意義（P<0.05）。臨床病理參數分析提示，CXCR3的表達與乳腺癌組織分化程度及淋巴結轉移呈正相關，而與乳腺癌患者的年齡、腫瘤分期及大小等無關。結論 乳腺癌組織中存在I-TAC及其受體CXCR3的過度表達，I-TAC/CXCR3信號傳導通路可能在乳腺癌發生、發展過程可能扮演重要角色。

【關鍵詞】趨化因子；I-TAC；CXCR3；乳腺癌。

Abstract Objective： To detect the expression of I-TAC and its receptor CXCR3 in brest carcinoma， and to explore the role of I-TAC/CXCR3 biological axis in the occurrence and development of breast cancer. Methods： 40 cases of breast cancer tissues from general surgery of Binzhou Central Hospital affiliated to Binzhou Medical College were collected as experimental group， and 40 cases of normal breast tissues adjacent to cancer were collected as control group. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemistry were used to detect the expression of I-TAC and CXCR3 at mRNA and protein levels， respectively. Finally， the relationship between the expression of CXCR3 and common clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed. Results： The expression of I-TAC and CXCR3 in breast cancer tissues was significantly higher than that in adjacent breast tissues （P < 0.05）. The expression of CXCR3 was positively correlated with histological differentiation and lymph node metastasis of breast cancer， but not with age， tumor stage and size of breast cancer patients. Conclusion： I-TAC and its receptor CXCR3 are overexpressed in breast cancer tissues， and I-TAC/CXCR3 signaling pathway may play an important role in the occurrence and development of breast cancer.

Key words Chemokines；I-TAC；CXCR3；Breast carcinoma.

【中圖分類號】R446.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）19-0-01

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，據2016年世界癌癥組織發布的臨床腫瘤資料顯示全球范圍內每年新發乳腺癌患者近200萬，約占女性所有惡性腫瘤的四分之一，而每年因乳腺癌而死亡的患者超過60萬人，約占女性惡性腫瘤死亡人數的20%[1]。在國內，乳腺癌自上世紀70年代末以來發病率一直呈逐年上升趨勢，已發展為女性發病率第一的惡性腫瘤。2016年中國新發乳腺癌患者約20萬人，高居女性惡性腫瘤發病率的首位，嚴重威脅女性健康。乳腺癌的預防和診治已成為全世界面臨的重大公共衛生問題[2]。盡管目前乳腺癌的基礎研究與臨床治療均取得較大的進步，但仍有接近35%的早期乳腺癌患者發生腫瘤的遠處浸潤或切除術后復發[3]，導致乳腺癌患者的死亡率居高不下。趨化因子的主要作用是趨化細胞的遷移， 趨化因子通過與受體結合激活后，可引起腫瘤增殖、分化、侵襲及轉移等信號通路的活化。目前證實趨化因子受體及其配體在多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、子宮內膜癌、胃癌及結直腸腫瘤等組織中均高表達。本文通過RT-PCR技術以及免疫組化技術分別檢測趨化因子I-TAC及其受體CXCR3在乳腺癌組織中的表達水平，并初步揭示I-TAC/CXCR3信號通路在乳腺癌發生、發展過程中的作用。

1 材料與方法

病歷資料及試劑： 所有乳腺癌患者臨床及病理資料齊全，且術前均未進行過任何形式的抗腫瘤治療。癌旁正常乳腺組織為距離腫瘤5 cm以外的正常乳腺組織，且病理切片未見腫瘤細胞。患者年齡33-72歲，平均年齡45歲。乳腺癌患者中有淋巴結轉移29例、無轉移11例。TNM 分期： I 期 11 例，Ⅱ期 20 例，Ⅲ期 9 例。組織學分級： I 級 5 例，Ⅱ級 17 例，Ⅲ級 18 例。鼠抗人CXCR3抗體（ab64714）購于abcam公司，兔抗人I-TAC單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司， CXCR3及I-TAC 抗體均采用1：200稀釋，DAB顯色、蘇木素復染透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。PBS代替一抗做陰性對照。

1.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測 I-TAC 及 CXCR3 mRNA的表達：分別收集乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織，并用 Trizol 法提取總RNA。根據TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書，進行cDNA合成和PCR擴增。引物根據Medline基因文庫用Primer 5.0軟件自行設計，目的基因I-TAC引物：上游：5-CAAGGCTTCCCCATGTTCA-3；下游：5-CCCAGGGCGTATGCAAAGA-3；產物長度為105 bp，退火溫度為60℃。CXCR3引物：上游：5-GCCCAAGAATAGATGCTGACTG-3下游：5-TGAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3；產物長度為165 bp，退火溫度為56℃。內參β-actin的上游引物為：5-CAACGGCTCCGGCATGT-3，下游引物為：5-CCACACGCAGCTCATTGTAGAA-3，預計擴增片段為257 bp，退火溫度55℃。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、Bio-PAD凝膠成像系統分析電泳條帶灰度值。目的條帶mRNA表達相對強度=目的條帶mRNA灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 免疫組織化學染色及結果判定：采用SP法，組織切片常規脫蠟至水洗；3%的過氧化氫處理10 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min；滴加封閉液（10%山羊血清）15 min；加一抗37℃2 h（陰性對照用PBs代替一抗）；PBS洗3次，每次5 min；生物素標記二抗37℃15 min；PBS洗3次，每次5 min；過氧化物酶（HRP）標記鏈霉卵白素15 min；PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色3 min；水洗，蘇木精復染、封固。隨機選取10個視野，計算每個高倍視野（×400）下分別計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞數占細胞總數的百分比，取均值，并由兩位有經驗的病理醫師分別雙盲閱片，按腫瘤細胞陽性細胞率和著色強度分別進行記分。

1.4 統計學處理：所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件進行檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 I-TAC、CXCR3 mRNA水平的表達：I-TAC mRNA在乳腺癌組中相對表達量為0.76 ± 0.11，在癌旁正常乳腺組織中表達為0.39 ± 0.07，兩者比較差異有統計學意義（P<0.01）。CXCR3在乳腺癌組織中mRNA水平的相對表達量為0.85±0.10，而在癌旁正常乳腺組織中表達為0.44±0.09，差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

2.2 I-TAC、CXCR3 蛋白水平的表達：I-TAC在乳腺癌組有32例陽性表達，陽性率80.0%，而其在癌旁正常乳腺組有22例陽性表達，陽性率55.0%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）；乳腺癌組CXCR3表達陽性的27例，陽性率67.5%，而癌旁相應正常乳腺組織中CXCR3表達陽性有16例，陽性率40.0%。兩組比較差異有統計學意義（P<0.05，見表2）。

2.3 CXCR3表達與乳腺癌常見臨床病理參數的關系：CXCR3表達與乳腺癌患者組織分化程度及腋窩淋巴結轉移有關（X2 = 8.391、5.277，P<0.05）。結果提示，腫瘤低分化組及淋巴結轉移組乳腺癌患者CXCR3陽性表達率均分別高于腫瘤高分化組及淋巴結無轉移組。CXCR3表達高低與乳腺癌患者年齡，病理分期以及腫瘤大小等無顯著關系。

3 討論

趨化因子受體CXCR3是一種G蛋白偶聯受體，包括三種結構類似的特異性配體如干擾素γ誘生單核因子（MIG，又名CXCL9），干擾素γ誘導性肽10（又名CXCL10）以及干擾素誘導的T細胞α趨化因子（I-TAC，又名CXCL11）等，CXCR3與其配體結合后能誘導活化的效應細胞向特定組織遷移，參與機體免疫和腫瘤的發生、發展和轉移[4]。多篇文獻報道CXCR3在消化道系統腫瘤、血液系統腫瘤以及婦科腫瘤等多種不同腫瘤組織中表達活躍，基礎研究也證實，趨化因子可能在腫瘤侵襲、轉移過程中扮演重要角色，包括穿入血管、錨定、穿出血管、免疫逃逸以及血管生成等，CXCR3與腫瘤轉移有關的可能機制是CXCR3高表達的惡性腫瘤細胞容易遷徙至表達其配體的特異性靶器官[5]。CXCR3在在結腸癌、胃癌和肝癌等腫瘤組織中陽性表達率較高，而在其相應癌旁組織或正常上皮組織中表達較弱或者不表達，且CXCR3的表達與病理分期、腫瘤組織分化或淋巴結轉移等密切相關，此外，CXCR3強陽性的腫瘤患者預后一般較差[6]。文獻亦有報道趨化因子受體CXCR3與其配體在腫瘤中的作用，如BAI[7]等報道結腸癌組織中CXCR3及CXCL10是表達顯著上調的，且CXCR3的表達水平高低可以作為評估進展期結腸癌患者預后的重要指標。腎癌細胞可高表達趨化因子受體CXCR3，并通過與配體CXCLl0相互作用，介導腎癌細胞的遠處轉移和侵襲[8]。許超等[9]報道了CXCR3-CXCLl0生物軸在結直腸腫瘤中的作用，通過體外遷移實驗發現CXCLl0對高表達CXCR3的結腸癌細胞SW620和HT29的趨化作用非常顯著，而低表達CXCR3的結腸癌細胞SW480趨化作用不明顯，這些結果初步提示體內CXCLl0對高表達CXCR3的腫瘤細胞具有一定趨化作用。目前I-TAC/ CXCR3在乳腺癌組織中的作用尚未見報道。我們通過運用RT-PCR法和免疫組織化學技術檢測乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中I-TAC及CXCR3的表達，發現乳腺癌組織中I-TAC及CXCR3無論mRNA水平還是蛋白水平的表達均顯著高于癌旁正常乳腺組織。如CXCR3在乳腺癌組27例陽性表達，陽性率為67.5%；CXCR3在癌旁正常乳腺組織中16例陽性表達，陽性率為40.0%；I-TAC在乳腺癌組有32例陽性表達，陽性率80.0%，I-TAC在癌旁正常乳腺組織中有22例陽性表達，陽性率為55.0%。此外，臨床病理參數分析提示CXCR3的表達與腫瘤組織分化及腋窩淋巴結轉移等密切相關，證實I-TAC/ CXCR3生物軸在乳腺癌侵襲、轉移過程中發揮一定的作用。

趨化因子受體及配體系統與腫瘤的關系具有雙向性[10-11]。趨化因子受體及其配體網絡調控受諸多因素的影響，故其與腫瘤發生、發展的關系還有待深入研究。但可以預見， 合理的應用趨化因子或其受體可有效地誘導、活化、趨化免疫效應細胞， 引導殺傷腫瘤細胞。因此，趨化因子相關的基因靶向治療有望成為新的腫瘤治療策略和手段。

參考文獻

Jemal A， Bray F， Center M M， et al. Global cancer statistics[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians， 2015， 61（2）：69-90.

韓小偉， 柳偉偉， 陽澤龍，等. 軍事醫學科學院附屬醫院乳腺癌臨床流行病學16年演變趨勢[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2016， 23（24）：1597-1600.

駱成玉. 乳腺癌治療從標準到精準微創[J]. 首都醫科大學學報， 2016， 37（3）：331-335.

Zhou H， Wu J， Wang T， et al. CXCL10/CXCR3 axis promotes the invasion of gastric cancer via PI3K/AKT pathway-dependent MMPs production[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2016， 82：479-488.

Xia J B， Mao C Z， Chen Z Y， et al. The CXCL10/CXCR3 axis promotes cardiac microvascular endothelial cell migration via the p38/FAK pathway in a proliferation-independent manner.[J]. Experimental & Molecular Pathology， 2016， 100（2）：257-265.

Xia J B， Liu G H， Chen Z Y， et al. Hypoxia/ischemia promotes CXCL10 expression in cardiac microvascular endothelial cells by NFkB activation.[J]. Cytokine， 2016， 81：63-70.

Ming B， Xia C， Ba Y I. CXCL10/CXCR3 overexpression as a biomarker of poor prognosis in patients with stage II colorectal cancer[J]. Mol Clin Oncol， 2016， 4（1）：23-30.

徐遵禮， 王林輝， 陳偉，等. CXCR3在腎細胞癌中的表達及其臨床意義[J]. 第二軍醫大學學報， 2012， 33（6）：690-691.

許超，王強，蔡清萍，等。CXCR3在結直腸癌組織中的表達及臨床意義[J]. 中華實驗外科雜志.2005，25（5）：609-611.

陳瑜，張德新，郭長存，等.趨化因子受體CXCR3在胃癌中的表達[J] 胃腸病學，2004，9（5）：266-269。

丁小霞，王健. 趨化因子受體CXCR3在HCC中的作用[J]. 細胞與分子免疫學雜志（Chin J Cell Mol Immuno1）2009，25（4）：374-376.