失神經性肌萎縮動物模型制備方法的研究進展①

趙丹丹，唐成林，黃思琴，羅翱，張安寧，安薈羽，吳夢佳，譚程方

1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市400016；2.中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

骨骼肌是周圍神經的靶器官。神經長期受損后，靶肌肉會發生不可逆性肌萎縮；即使之后再行顯微外科術縫合神經，靶肌肉功能活動依舊不能完全恢復。

失神經肌萎縮的調控機制復雜，蛋白質的分解合成水平失衡、肌細胞凋亡增加、肌衛星細胞池耗竭等均參與其中[1-2]，這些機制又受多種信號通路調控[3]。針灸、推拿能有效延緩失神經肌萎縮，為神經再生修復提供良好肌肉條件[4-5]，但其作用機制尚未完全闡明。

神經損傷的部位和程度不同，靶肌肉萎縮程度不同。造模方法的選擇和優化對深入探討針灸、推拿延緩失神經性肌萎縮的相關機制十分重要。

1 外源性神經損傷模型

多種外源性理化刺激均可誘導神經損傷后靶肌肉失神經肌萎縮，常見的有手術損傷、物理因素損傷和化學因素損傷。實驗對象以小型嚙齒類動物(大鼠、小鼠、家兔等)為主，多以靶肌肉的肌濕重比、肌纖維截面積或纖維直徑的下降作為判斷造模成功的標準[4-6]。

1.1 手術損傷

外源性神經損傷所致失神經肌萎縮的動物模型中，應用最多且最被承認的是手術機械性損傷模型。損傷部位多為粗大的周圍神經干、神經叢根部或脊髓。

1.1.1 周圍神經干損傷

此類模型多選擇損傷周圍神經主干(如坐骨神經)或其較大分支(如脛神經、腓總神經等)；損傷方式常見橫斷傷、急性鉗夾傷、慢性卡壓傷。神經損傷程度可根據Sunderland[7]提出的神經損傷Ⅴ度分類法進行評估。

1.1.1.1 橫斷傷

Huang等[8]于大鼠右側坐骨結節處行手術切口，分離臀大肌和股二頭肌后暴露坐骨神經，于梨狀肌下緣切除坐骨神經長約3～5 mm，將神經兩斷端翻轉180°后縫合于鄰近組織。造模后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d，模型組腓腸肌濕重比、纖維截面積及直徑均進行性減小，提示造模成功。橫斷坐骨神經主干可造成SunderlandⅤ度損傷；將神經斷端固定以防止側支吻合發生，較僅橫斷坐骨神經而不固定斷端的造模方法[9]更為嚴謹。

有研究者認為，離斷坐骨神經主干會誘發對側肢體代償性肥大，導致實驗結果偏差，他們主張通過離斷坐骨神經下游分支(如脛神經[4]或腓總神經[10])制備失神經肌萎縮模型，手術入路和方法均與前者相似。Su等[4]以脛神經離斷小鼠為模型，發現電針能通過調控生肌調節因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)及肌肉生長抑素(myostatin,MSTN)信號通路相關蛋白的表達，促進肌肉再生，延緩失神經肌萎縮。

離斷周圍神經的模型均能較好模擬神經橫斷傷后靶肌肉不可逆性萎縮的病理機制，且操作簡便，重復性好，損傷程度較為統一，便于定量分析，適用于針灸、推拿延緩下肢失神經肌萎縮機制的長期研究。

1.1.1.2 急性鉗夾傷

Wu等[11]以12.5 cm長的顯微外科止血鉗鉗夾大鼠坐骨神經3次，每次10 s，間隔10 s。造模后0 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d，模型組坐骨神經功能指數(sciatic functional index,SFI)逐漸回升，腓腸肌濕重比及纖維截面積先下降后升高。但該實驗并未說明神經的損毀程度。

周嵐等[12]以14 cm長的止血鉗全齒鉗夾腓總神經3次，每次10 s，間隔10 s，損傷寬度5 mm。術后損傷處神經絲蛋白熒光信號完全消失，表明軸突完全斷裂，提示造成腓總神經SunderlandⅡ度損傷。

Gigo-Benato等[13]以無齒鉗予脛神經約54 N壓迫，持續30 s，造成3×2 mm損傷區，術后2周病理學和功能學指標[12-13]證實造模成功。

Pan等[14]以無齒鉗鉗夾大鼠坐骨神經30 s，發現電針干預能通過調控腓腸肌中組織纖維蛋白溶酶原激活質(tissue plasminogen activator,tPA)及其抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的表達，促進神經修復，延緩失神經肌萎縮。

與神經橫斷傷相比，鉗夾坐骨神經主干或其分支可造成SunderlandⅡ～Ⅲ度損傷，損傷程度較輕，神經損傷后可再生修復，靶肌肉萎縮可逆，能較好模擬神經急性鉗夾傷后靶肌肉萎縮的病理機制，適用于針灸、推拿延緩下肢失神經肌萎縮的短期研究。目前該類型造模方法仍存在缺點：鉗夾器材的規格、型號，壓迫神經的力度、時間、間隔，反復壓迫的位點等不同，會導致神經損傷程度不同，較難進行統一定量分析。

1.1.1.3 慢性卡壓傷

周圍神經慢性卡壓傷臨床極為常見。基礎研究多通過結扎坐骨神經模擬慢性卡壓傷，探討神經病理性疼痛的相關機制[15]。車光昇等[16]用外科縫合線雙重結扎大鼠左側坐骨神經，術后4周，模型組術側骨骼肌纖維截面積及直徑較正常組減小，提示造模成功。但該模型并未介紹卡壓神經所用縫線的規格、材質，以及結扎神經的力度，且未進行神經損傷程度評估。

1.1.2 神經叢根部損傷

此類模型多選擇臂叢神經，手術入路有前入路和后入路，損傷方式多為根部撕脫傷，用以模擬臨床分娩性臂叢神經損傷。目前研究多集中于神經性疼痛及神經修復方面[17]。

潘峰[18]取鎖骨下路行右鎖骨上-頸部聯合切口，暴露位于前中斜角肌肌間隙內的臂叢神經干根部，行C5～T1全臂叢神經根撕脫術。術后1周、5周、10周、15周，大鼠前肢爪內肌與肱二頭肌纖維截面積維持率逐漸下降，術后5周靶肌肉中運動終板熒光強度明顯減弱，提示造模成功。該實驗通過改良前入路法行全臂叢撕脫術，引起術側上肢不可逆性肌萎縮，較好模擬分娩性臂叢神經損傷的病理機制，較后入路法可靠性強、創傷小、成功率高。

1.1.3 脊髓損傷

此類模型多選擇損傷胸腰段脊髓節段，損傷方式多見沖擊傷和橫斷傷。與上述造模方式相比，具有損傷嚴重程度高、術中出血量大、動物存活率低的特點。

1.1.3.1 橫斷傷

Wu等[19]剝除大鼠椎板，暴露T9-10脊髓節段，顯微手術剪在T10節段橫斷脊髓。術后14周，模型組比目魚肌及股四頭肌濕重比降低，提示造模成功。Zhang等[20]以橫斷T10節段脊髓的大鼠為模型，發現電針能通過調控神經營養素-3(neurotrophin-3,NT-3)的表達，保護運動神經元，延緩失神經肌萎縮。

上述模型能較好模擬低位截癱的病理機制，損傷程度易于量化，適用于針灸、推拿對低位截癱的長期療效研究。但因模型損傷程度重，對術后動物的護理要求較高。

1.1.3.2 急性撞擊傷

Wei等[21]剝除大鼠椎板暴露脊髓節段，將10 g金屬棒從12.5 mm高度自由下落，造成T10節段脊髓損傷。術后0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d，模型組脊髓損傷BBB評分逐漸回升，術后7 d和14 d比目魚肌纖維直徑較假手術組減少，提示造模成功。

Bramlett等[22]以T10節段急性撞擊傷大鼠為模型，發現低頻振動雖不能延緩失神經性肌萎縮，但可通過上調Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)等因子表達，減少骨質丟失。

此種模型通過重物打擊造成脊髓急性鈍挫傷，使損傷平面以下出現可逆性失神經肌萎縮。與脊髓橫斷傷相比，具有損傷程度輕、動物存活率高的優點。但存在重物下落點易偏移、模型不易量化的缺點。

還有研究者[23]通過建立神經損傷再修復模型，研究神經再支配后靶肌肉萎縮及恢復的相關機制。該模型對神經斷端的狀態要求較高，對神經吻合的操作技術要求亦高，神經縫合后恢復程度難以進行統一量化分析，較少應用。

1.2 物理因素損傷

除手術外，亦有研究者應用其他物理因素損傷神經，制備失神經肌萎縮模型。

Tamaki等[24]分離出大鼠坐骨神經，將直徑5 mm的不銹鋼棒從液氮中取出，立即置于坐骨神經上5 s。術后予電刺激。結果顯示，模型組脛前肌、趾長伸肌和比目魚肌濕重比及脛前肌纖維截面積減少，提示造模成功；電刺激能有效延緩骨骼肌中毛細血管消退，進而延緩失神經性肌萎縮。

液氮凍傷可造成SunderlandⅣ度損傷(神經外膜存在而神經內部結構完全斷裂)，從而保證神經損毀程度基本一致，方便定量研究。但該造模方法對實驗條件要求較高，操作中對動物的護理要求較高，且因液氮易造成周圍軟組織急性凍傷，不符合臨床失神經肌萎縮的病理機制，較少應用。

徐鵬等[25]利用高強度聚焦超聲精確定位并損傷坐骨神經：將新西蘭大白兔實驗側腿全部浸于蓄水池中并固定，超聲治療頭對準膝關節平面以上1.5 cm處，8.5 MHz B型超聲顯示坐骨神經，JC型聚焦超聲治療系統輻照。造模1周、2周、4周，輻照側腓腸肌及比目魚肌濕重、腓腸肌纖維截面積和直徑逐漸減小；輻照側坐骨神經出現黏液樣、空泡樣變性，提示造模成功。該實驗未進行神經損傷程度評估。

該造模方法具有創傷小、操作簡便、定位準確的優點，但因所需實驗條件較高，且不符合臨床失神經肌萎縮的病理特點，較少應用。

1.3 化學因素損傷

臀肌注射引起的醫源性坐骨神經損傷是全球性問題，尤以發展中國家多見。許多藥物具有神經毒性，一旦累及神經，將引發下肢肌萎縮甚至肢體殘疾。

Yu等[26]分離、暴露大鼠坐骨神經，用4號針頭將20萬U青霉素鈉(0.5 ml)注射于神經干偏外側外膜下，術后予電針干預。結果表明，損傷后1周、2周、4周、6周，大鼠SFI逐漸回升，脛前肌濕重及纖維截面積先減少后增加，提示造模成功；電針干預可能通過調控脛前肌中聚集蛋白(agrin)、成熟型乙酰膽堿受體(acetylcholine receptorεsubunit,AChR-ε)和胚胎型乙酰膽堿受體(acetylcholine receptorγsubunit,AChR-γ)的表達，促進神經肌接頭再生修復，延緩失神經肌萎縮。

造模過程中應注意避免因藥液滲漏引起而造模程度的不同。

2 內源性神經病變模型

神經自身病變也可引起靶肌肉神經源性損害，如肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、脊肌萎縮癥、進行性延髓麻痹等，發病原因尚不明確。目前基礎研究中，應用最多的是ALS模型，實驗動物多選擇小鼠。

ALS是一種慢性漸進性疾病，主要由于上/下運動神經元退行性障礙導致神經元死亡，出現漸進性四肢乃至全身肌肉無力、萎縮，并伴有錐體束征[27]。多種超氧化物歧化酶-1(type-1 superoxide dismutase,SOD-1)基因突變被證明與ALS相關，且以G93A位點突變多見。將人突變的hSOD1G93A基因轉導入B6SJL小鼠(雌性C57BL/6小鼠和雄性SJL小鼠的雜交后代)是目前公認的ALS轉基因動物模型。這類小鼠通常在出生3個月后開始出現進行性加重的ALS樣癥狀[28]，多以肢體抓握力、抓握時間，腓腸肌最大收縮力等指標評估其肌無力程度。

Cai等[29]對14周齡ALS小鼠予蜂毒針干預，結果表明，蜂毒針能通過調控股四頭肌中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、B細胞淋巴瘤2因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和脊髓中Toll樣受體-4(Toll-like receptors 4,TLR-4)等因子表達，保護運動神經元，減輕骨骼肌炎性反應，延緩肌萎縮。

此類轉基因動物為探討針灸、推拿延緩ALS的機制奠定了基礎。

3 總結與展望

目前，損傷周圍神經和脊髓是建立失神經性肌萎縮模型的主要方法。Shahidi等[30]的研究表明，大腦皮質損傷后，參與骨骼肌失神經萎縮的調控機制更加復雜。選擇符合臨床實際的失神經肌萎縮動物模型、進行模型優化及統一定量分析，對今后探討針灸、推拿延緩失神經肌萎縮的機制至關重要。

除原發性失神經損傷外，其他多種誘因，如制動、疾病、衰老等，也可通過影響骨骼肌的營養代謝引起肌萎縮。目前較多研究著眼于以下幾種類型肌萎縮：廢用性肌萎縮[31]、失重性肌萎縮[32]、Duchenne肌營養不良[33]、衰老性肌減少癥[34]、藥源性肌萎縮[35]、癌癥惡病質性肌萎縮[36]，因糖尿病[37]、各種器官衰竭(心[38]、肺[39]、腎[40])等疾病狀態引起的肌萎縮等。這些實驗研究為探討針灸、推拿延緩相應生理病理狀態下肌萎縮的機制提供了新的思路。

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