黑色素微粒修飾阿霉素對甲狀腺未分化癌細胞耐藥性的影響

張余春 張青 楊昱 趙一璟 王昆 馬向華

[摘要] 目的 探究黑色素微粒修飾阿霉素（DOX-MNPs）對甲狀腺未分化癌細胞（ATC）耐藥性的影響。 方法 合成多巴胺黑色素納米粒（MNPs）并加載阿霉素（DOX），紫外-可見光譜法測定不同質量比下MNPs的載藥效率和容量，透射電子顯微鏡（TEM）和Brookhaven Zeta PALS分析儀分析納米顆粒的特性。不同濃度的游離DOX和DOX-MNPs（0、10、20、40、80、160 mg/L）作用于ATC藥物敏感細胞株HTh74和耐藥細胞株HTh74R，MTT法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞對DOX的攝取能力。 結果 DOX-MNPs的負載效率隨DOX和MNPs質量比的增加而降低，當質量比為0.167∶1時，加載效果達到峰值93.45%，該質量比下得到的DOX-MNPs具有與MNPs相似的形態，動作電位和粒徑分布分別為13.79 mV和（241.1±4.8）nm。在HTh74R細胞中，DOX-MNPs濃度高于20 mg/L時，細胞活力顯著低于同等藥物濃度游離DOX（P < 0.05），DOX-MNPs的攝取率明顯高于游離DOX（P < 0.05），與HTh74細胞的攝取程度相似。 結論 在耐藥HTh74R細胞中，DOX-MNPs的細胞攝取能力和治療效果顯著高于同等藥物濃度下的游離DOX。

[關鍵詞] 甲狀腺未分化癌；耐藥性；阿霉素；多巴胺黑色素納米粒

[中圖分類號] R736.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0004-05

[Abstract] Objective To research the influence of Doxorubicin loaded melanin nanoparticles （DOX-MNPs） on drug resistance of anaplastic thyroid cancer （ATC） cells. Methods Dopamine-melanin nanoparticles （MNPs） were synthesized as previously reported and Doxorubicin （DOX） was loaded onto MNPs. The loading efficiency and capacity of MNPs at different mass ratios of DOX to MNPs were determined by UV-Vis spectroscopy and the characterization of nanoparticles was acquired by transmission electron microscopy （TEM） and Brookhaven Zeta PALS analyzer. HTh74 and HTh74R cells were incubated with various concentrations of free DOX and DOX-MNPs （0， 10， 20， 40， 80， 160 mg/L）. Cell viability was determined by MTT， and intracellular DOX fluorescent signal was determined by flow cytometry studies. Results The MNPs was successfully synthesized and the loading efficiency of DOX-MNPs decreased with the increasing mass ratio of DOX to MNPs. The loading efficacy peaked at 93.45% when the mass ratio was 0.167：1. At this mass ratio， the obtained DOX-MNPs had similar morphology to MNPs， and zeta potential and size distribution of DOX-MNPs were 13.79 mV and （241.1±4.8） nm. In HTh74R cells， when the concentration of DOX-MNPs was higher than 20 mg/L， the cell viability was significantly lower than that of the equivalent drug concentration （P < 0.05）， and the uptake rate of DOX-MNPs was significantly higher than that of free DOX （P < 0.05）. The degree of uptake was similar to that of HTh74 cells. Conclusion The cellular uptake capacity and therapeutic effect of the DOX-MNPs are significantly higher than those of free DOX at the same drug concentration in drug-resistant HTh74R cells.

[Key words] Anaplastic thyroid carcinoma； Drug resistance； Doxorubicin； Dopamine-melanin nanoparticles

甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）是死亡率最高的癌癥之一[1-4]，該病的5年生存率低至7%[5]。ATC是一種高度惡性腫瘤，它的標準化治療是阿霉素（Doxorubicin，DOX）化療聯合放療[6]。然而，ATC細胞常對DOX產生耐藥性，從而導致療效不佳[7-8]。因此，克服細胞耐藥性的問題對改善ATC預后十分重要。ATC產生耐藥性的關鍵機制在于多藥耐藥基因1（multidrug-resistant 1，MDR1）轉運體的表達[9]。MDR1轉運體將DOX分子泵出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低，從而影響化療效果[7，10]。許多研究將納米微粒作為藥物載體以克服腫瘤細胞耐藥性的問題[11-12]。納米微粒通過增加細胞攝取或者抑制藥物流出，能夠高效運輸藥物并增加細胞內藥物濃度。已經有研究報道將納米微粒作為增強ATC療效的藥物的轉運體，如脂質體[13]和納米探針[14]，證實了納米載體的可行性。然而，利用納米微粒是否能改變ATC耐藥性目前鮮見相關報道。本研究合成了負載阿霉素分子的多巴胺黑色素納米粒（dopamine-melanin nanoparticles，MNPs）。黑色素存在人體許多組織中，如皮膚、毛發、眼睛，具有極佳的生物相容性[15-18]；DOX分子能夠通過靜電作用和/或π子能堆積作用吸附在MNPs表面從而進入細胞中[19]。本研究分別在藥物敏感性細胞株HTh74和耐藥細胞株HTh74R兩類ATC細胞中研究DOX-MNPs的細胞攝取情況及治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸多巴胺、乙醇和MTT試劑購自Sigma公司；阿霉素、28%～30%濃度的氨水、二甲基亞砜（DMSO）購自阿拉丁試劑網。F-12培養基[1%MEM培養基（100×）、1%兩性霉素、1%青霉素（500×）、1%鏈霉素（500×）、10%胎牛血清]；磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）購自凱基生物公司；流式細胞儀（型號Guauasoft 6 L）購自美國Milipor公司；JEOL JEM-2100顯微鏡購自日本電子株式會社公司；PrimelMer-LAMBDA 35紫外可見分光光度計購自美國珀金埃爾默公司；Brookhaven Zeta PALS分析儀購自美國布魯克海文儀器公司。

1.2 合成MNPs

MNPs合成方法與Li等[19]研究方法相同。即將8 mL乙醇和0.6 mL氨水與18 mL超純水混合，30℃水浴中攪拌至少30 min。加入50 mg/mL鹽酸多巴胺2 mL，繼續攪拌24 h，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，再次離心，離心3次。收集沉淀顆粒，并在1 mg/mL濃度的超純水中再分散，以備進一步使用。

1.3 MNPs修飾DOX

在獲得的MNPs表面加載DOX，將DOX（0.5 mg/mL）的溶液與上述的MNP懸浮液混合，其質量比為0.167∶1～2∶2（DOX∶MNPs）。將混合物在室溫下攪拌24 h，然后進行2次離心（13 000 r/min 離心15 min）和再懸浮處理。紫外-可見光譜法測定上清液中游離DOX的含量，從而確定不同質量比（DOX∶MNPs）情況下MNPs的載藥效率和容量。DOX-MNPs在超純水中再分散，以進一步使用。

1.4 納米顆粒的特性描述

使用JEOL JEM-2100顯微鏡獲得MNPs的透射電子顯微鏡（transmission electronmicroscopy，TEM）圖像。用PrimelMer-LAMBDA 35紫外可見分光光度計測定MNPs的紫外-可見光譜。使用Brookhaven Zeta PALS分析儀測量納米顆粒的尺寸和動作電位。

1.5 MTT試驗

敏感性細胞株HTh74和耐藥細胞株HTh74R在5%CO2、37℃環境下的96孔板中培養24 h。隨后將細胞與各種濃度的游離DOX（0、28、56、112、225、450 mg/L）、MNPs和DOX-MNPs（0、10、20、40、80、160 mg/L）一起孵育24 h。孵育后的細胞用冷PBS洗滌3次，用0.5 mg/mL MTT培養4 h，懸浮于DMSO中。酶標儀570 nm波長檢測吸光度。

1.6 流式細胞分析

HTh74、HTh74R和HEK 293細胞株在5%CO2、37℃環境下的12孔板中培養24 h。隨后用游離DOX（40 μg/mL）或與DOX濃度等效的DOX-MNPs孵育6 h。然后用冷PBS洗滌細胞3次，收集并再分散在PBS中，上流式儀檢測。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0統計學軟件進行數據分析，兩組細胞存活率比較采用t檢驗，以P < 0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 合成MNPs

根據上述方法成功合成MNPs。TEM圖像顯示獲得的MNPs是直徑（148.9±13.3）nm的納米顆粒（圖1）。流體動力學直徑在（215.7±5.8）nm，比TEM圖像中略大。動態光散射（dynamic light scattering，DLS）測量結果是（-25.3±3.2）mV負動作電位。

2.2 Dox-MNPs在不同質量比下的載藥效率和載藥容量

DOX-MNPs的負載效率隨DOX和MNPs質量比的增加而降低（圖2）。質量比為0.167∶1時，加載效果達到峰值93.45%。然而，DOX-MNPs的負載效率為12.64%～19.43%時，載藥效率和載藥容量與質量比的變化無關。

2.3 DOX-MNPs在不同質量比下的動作電位和流體動力學直徑

DOX-MNPs的動作電位隨著質量比的增加而降低（與質量比為0相比，P < 0.05）。質量比大于0.25時，獲得的DOX-MNPs的動作電位從負向中性轉變。隨著動作電位的變化，DOX-MNPs的流體動力學直徑隨質量比的增加而增大。見圖3。

DOX與MNPs的質量比確定為0.167∶1。TEM圖像表明，在該質量比下得到的DOX-MNPs具有與MNPs相似的形態（圖4）。動態光散射測量顯示，該質量比下，DOX-MNPs的動作電位和粒徑分布分別為13.79 mV和（241.1±4.8）nm（圖3）。

2.4 不同MNPs、DOX-MNPs濃度培養下的細胞活力比較

MTT試驗表明，MNPs濃度<450 mg/L時無明顯的細胞毒性（圖5）。與游離DOX或DOX-MNPs孵育24 h后，HTh74細胞在同等濃度DOX下的存活率相似（圖6）。相反，在HTh74R細胞中，DOX-MNPs濃度>20 mg/L時產生的治療效果顯著高于同等濃度的游離DOX（P < 0.05）。最高測試濃度下（160 mg/L），游離DOX孵育的HTh74R細胞的存活率為（72.3±6.5）%，而DOX-MNPs孵育的HTh74R細胞存活率減少至（34.6±5.4）%。

2.5 游離DOX/DOX-MNPs培養下ATC細胞對DOX的攝取能力比較

熒光激活細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）結果顯示，HTh74細胞中游離DOX與DOX-MNPs的攝取程度相似（圖7a）。當其與HTh74R細胞孵育時，游離DOX的攝取率低于與HTh74細胞孵育時的攝取率，而DOX-MNPs的攝取程度與其在HTh74細胞的攝取程度相似（圖7b），HEK293細胞中游離DOX和DOX-MNPs的攝取程度相似（圖8）。

3 討論

本研究成功合成了負載阿霉素分子的多巴胺黑色素納米粒，通過π-π堆疊和氫鍵相互作用，DOX分子可以通過附著在MNPs表面而進入細胞中發揮治療作用。

藥物負載成功的難點是確定合適的藥物與載體質量比。納米顆粒可以以最小的粒子間橋接，保持載藥后的膠體穩定性[20]。DOX與MNPs的質量比為0.167∶1時，加載效果達到峰值；TEM圖像提示，在該質量比下得到的DOX-MNPs具有與MNPs相似的形態。膠體穩定性對納米粒子的生物醫學應用至關重要，故后續的研究均采用了該質量比。

為了進一步評估MNP的生物相容性，本研究將HTh74細胞和HTh74R細胞與不同濃度的MNPs孵育以觀察細胞毒性。研究結果顯示，MNPs濃度<450 mg/L時無明顯的細胞毒性。比較同等濃度的游離DOX和DOX-MNPs對兩種ATC細胞活力的影響，發現DOX-MNPs未增強DOX對藥物敏感ATC細胞的治療效果，但能顯著抑制HTh74R細胞的耐藥性，提高治療效果。

為進一步了解DOX-MNPs提高療效的機制，本研究比較了HTh74和HTh74R細胞對游離DOX和DOX-MNPs的細胞攝取能力。研究結果顯示，在HTh74R細胞中，游離DOX的攝取程率小于與HTh74細胞孵育時的攝取率，DOX-MNPs的攝取率明顯高于游離DOX，與其在HTh74細胞中的攝取率相似。以上結果表明，HTh74R細胞的耐藥性可能與DOX內化不良有關，DOX-MNPs在HTh74R細胞中比游離DOX能夠更有效地內化，從而提高化療效果。為排除DOX-MNPs在正常細胞中增加對DOX攝取的可能性，本研究測定了HEK 293細胞中游離DOX和DOX-MNPs的細胞攝取，發現MNP給藥系統不會增強藥物對正常細胞的毒性。

綜上所述，本課題組合成了能夠高效負載DOX（93.45%）的多巴胺黑色素納米微粒。在耐藥HTh74R細胞中，DOX負載的多巴胺黑色素納米微粒的細胞攝取能力和治療效果顯著高于同等藥物濃度下游離DOX。本研究證實了黑色素納米微粒可以用來克服甲狀腺未分化癌耐藥問題。

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（收稿日期：2018-08-02 本文編輯：任 念）