siRNA干擾Rac1表達對人晶狀體上皮細胞增殖和遷移能力的影響

孫國慶 唐建明

[摘要] 目的 研究Rac1對人晶狀體上皮細胞SRA01/04增殖和遷移能力的影響，探究Rac1在后囊下混濁及囊袋皺縮綜合征發生、發展過程中的作用。 方法 將SRA01/04細胞分為Mock組和siRac1組，構建Rac1相關siRNA并瞬時轉染于siRac1組細胞中，Western blot檢測Rac1蛋白表達的變化，CCK檢測細胞生長周期的變化，流式細胞術檢測細胞周期、細胞凋亡變化，Transwell檢測Rac1對細胞遷移能力的影響。 結果 兩組72 h時吸光度值均高于24 h（P < 0.05），siRac1組48、72 h時吸光度值均低于Mock組（P < 0.05）；與Mock組比較，siRac1組mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，G1期細胞所占百分率明顯增高，S期細胞所占百分率明顯降低，穿越基質膜的細胞數明顯減少，差異均有統計學意義（P < 0.05）。F-actin染色結果顯示，siRac1組細胞的偽足形成能力較Mock組減弱。 結論 Rac1可能通過調節晶狀體上皮細胞的增殖能力和遷移能力，影響后囊下混濁及囊袋皺縮綜合征的發生、發展。

[關鍵詞] 后囊下混濁；囊袋皺縮綜合征；Rac1；晶狀體；上皮細胞

[中圖分類號] R776.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the effect of Rac1 on the proliferation and migration of human lens epithelial cells SRA01/04， and to explore the role of Rac1 in the development and progression of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome. Methods SRA01/04 cells were divided into mock group and siRac1 group. Rac1-related siRNA was constructed and transiently transfected in siRac1 group cells. Western blot was used to detect the changes of Rac1 protein expression， CCK was used to detect the changes of cell growth cycle， flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis， Transwell was used to detect the effect of Rac1 on cell migration ability. Results The absorbance values of the two groups at 72 hours were higher than those at 24 hours （P < 0.05）， the absorbance values of siRac1 group at 48， 72 hours were lower than those of mock group （P < 0.05）. Compared with mock group， the relative expression of mRNA and protein in siRac1 group decreased significantly， the percentage of G1 phase cells increased significantly， while the percentage of S phase cells decreased significantly， the number of cells passing through the membrane reduced significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05）. F-actin staining showed that the forming ability of pseudopodium in siRac1 group was significantly weaker than that of mock group. Conclusion Rac1 may affect the occurrence and development of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome through adjusting the proliferation and migration of lens epithelial cells.

[Key words] Posterior capsular opacities； Capsular contraction syndrome； Rac1； Lens； Epithelial cells

后囊下混濁（posterior capsular opacities，PCO）和囊袋皺縮綜合征（capsular contraction syndrome，CCS）是白內障超聲乳化術后常見并發癥，其發生與發展均與白內障術后殘留晶狀體上皮細胞的增殖與遷移有關[1-2]。Rac1是Rho家族重要成員之一，有促進細胞遷移、抑制細胞凋亡的作用[3]。近年來有文獻證實，Rac1可以促進大鼠視網膜新生血管的形成[4]，而且在人翼狀胬肉也有表達[5]。但Rac1作用于晶狀體上皮細胞的實驗研究較少。我們在人晶狀體上皮細胞SRA01/04中通過siRNA來干擾Rac1的表達以觀察其對細胞增殖和遷移能力的影響，從而驗證通過降低Rac1表達以降低PCO和CCS發生及進展的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養與分組 SRA01/04購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫，培養液為添加10%胎牛血清（美國，Gibco）的DMEM培養基（中國，吉諾），置于37℃、5%CO2培養箱中培養。轉染前1 d將處于對數生長期的SRA01/04細胞分為轉染空白組（Mock組）和基因沉默組（siRac1組），以5×105個/孔的濃度分別接種于6孔板中，每孔均添加2 mL無抗生素培養基，確定細胞平鋪均勻。

1.1.2 試劑與耗材 siRNA購自上海吉瑪公司，siRac1正義序列為5′-GGGAUGAUAAAGACACGAUTT-3′，反義序列為5′-AUCGUGUCUUUAUCAUCCCTT-3′；OPTI-MEMI（中國，吉諾）；Lipofectamin 2000（美國，Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 將1 OD siRac1加入150 μL DEPC水中，溶解后混合均勻配置成20 nmol/L的siRac1溶液。將5 μL Lipofectamin 2000和5 μL siRac1加入250 μL OPTI-MEMI中孵育20 min后轉入培養基已更換為OPTI-MEMI的6孔板中，每孔培養液總體積為2 mL。6 h后更換為完全培養基。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力 將轉染后細胞棄去培養基后胰酶消化，調整細胞數為5×104個/mL接種于96孔培養板。每孔加入100 μL細胞懸液，另設不加細胞的培養基為本底。分別培養24、48、72、96 h后，吸出培養基，每孔加入含10% CCK-8的普通培養基110 μL，37℃下孵育2 h。在Safire熒光酶標儀（美國，TECAN）490 nm波長處測量各孔的吸光度值。吸光度值大小表示細胞增殖能力的強弱。實驗重復3次。

1.2.3 Western blot檢測蛋白相對表達量 細胞轉染48 h后抽提細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后各取50 μg總蛋白在SDS-PAGE膠中進行凝膠電泳后轉印于PVDF膜，經Rac1一抗（美國，Abcam）孵育過夜，羊抗鼠二抗（美國，Santa cruz）室溫孵育2 h后HRP發光顯影。以GAPDH作為內參。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡 細胞周期檢測：將轉染后細胞胰酶消化后收集至試管中，經PBS洗滌后于70%的冰乙醇中固定置于4℃過夜，次日用PBS反復洗滌2次，在RNase A濃度為100 μg/mL、PI濃度為5 μg/mL的溶液中室溫避光孵育30 min。用FACSCalibur流式細胞儀（美國，BD）檢測。細胞凋亡檢測：Annexin V-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡。轉染后收集細胞并用PBS洗滌，離心后分別加入300 μL結合緩沖液，輕輕混勻細胞后再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育0.5 h后用流式細胞儀檢測。CellQuest軟件進行PCNA表達分析，確定表達PCNA細胞占檢測細胞的百分比，分析細胞增殖、周期及遷徙等。

1.2.5 細胞遷移能力檢測 24孔Transwell小室進行遷移實驗。細胞轉染后24 h胰酶消化后調整濃度為2.5×106個/mL，各取200 μL置于上室，下室中加入含有10%胎牛血清的完全培養基，培養48 h，取出Transwell小室，用棉簽擦去聚碳酸酯膜靠近內室一面的細胞，甲醛室溫固定10 min，結晶紫染色30 min，清水洗3遍，顯微鏡下觀察細胞，記數。

1.3 統計學方法

SPSS 19.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗比較Mock組和siRac1組的差異，其中重復測量設計采用重復測量數據的方差分析，各時間點的組間差異比較行獨立樣本t檢驗，各組的時間差異兩兩比較，行LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRac1對SRA01/04細胞增殖能力的影響

重復測量數據方差分析結果顯示，組別、時間以及組別×時間的交互作用差異均有統計學意義（均P < 0.05）。進一步組內兩兩比較結果顯示，與24 h比較，siRac1組和Mock組72 h時吸光度值均升高，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；組間比較結果顯示，siRac1組48、72 h時吸光度值均低于Mock組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

2.2 siRac1對SRA01/04細胞Rac1 mRNA及蛋白表達的影響

與Mock組比較[（86.16±10.21）%、（89.68±7.13）%]，siRac1組mRNA及蛋白相對表達量[（15.23±4.56）%、（17.63±4.17）%]均明顯降低，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見圖2。

2.3 siRac1對SRA01/04細胞周期的影響

與Mock組[（46.96±4.90）%]比較，siRac1組G1期細胞所占百分率[（62.43±5.40）%]明顯升高，差異有統計學意義（t = 8.249，P = 0.001）；與Mock組[（41.10±4.70）%]比較，siRac1組S期細胞所占百分率[（21.07±3.90）%]明顯降低，差異有統計學意義（t = 21.492，P = 0.000）。見圖3。

2.4 siRac1對SRA01/04細胞遷移能力及細胞骨架的影響。

siRac1組穿越基質膜的細胞數[（75±6）個]明顯少于Mock組[（135±5）個]，差異有統計學意義（t = 16.145，P = 0.000）。F-actin染色結果顯示，siRac1組細胞的偽足形成能力較Mock組減弱。見圖4。

3 討論

現代白內障手術的發展，已經將白內障手術推入屈光手術的范疇。所有可能會影響術后視覺質量的并發癥都會被每一個術者極力避免，其中包括PCO和CCS[6-7]。PCO即后發性白內障，是白內障摘除術后最常見的并發癥之一，其發病原因為白內障術后殘留的晶狀體上皮細胞遷移至后囊膜，進而分化為成纖維細胞[8-9]。

CCS表現為撕囊面積和晶狀體囊袋赤道部直徑縮小、前囊膜混濁、人工晶狀體偏心、傾斜或脫位。CCS發病率雖不及PCO，但其一旦發生不良后果將更加嚴重。CCS發病原因為白內障術后殘存的晶狀體上皮細胞纖維化，致前囊膜皺縮，嚴重者可致人工晶體脫位或脫入玻璃體，繼而引發眼內炎[10-12]。

因此PCO與CCS的發生都與白內障術后晶狀體后囊膜、赤道部和前囊膜下殘余的上皮細胞增殖、遷移有著直接的關系。白內障手術醫生通過控制撕囊大小、前囊膜、后囊膜拋光等手術技巧，可顯著降低CCS及PCO的發生率[13-15]。但手術技巧的提高并不能完全避免PCO及CCS的發生，尤其是兒童先天性白內障[1]。因此，阻斷晶狀體上皮細胞的增殖、遷移成為避免PCO及CCS發生最直接、最根本的方法。

Rho家族蛋白可以通過多種途徑參與和調節細胞的生長、凋亡和細胞周期的變化。Rac1是Rho家族小GTP酶之一，它在人體各組織中均有表達，已有文獻證實其參與腫瘤細胞侵襲遷移和周期調節。Rac1生物功能的發揮依賴于兩種活性形式間的轉換，且其具有調節細胞骨架重組、影響細胞形體極化、促進細胞運動與遷移、抑制細胞凋亡的作用[16-17]。目前Rac1是各個學科廣泛研究的熱點。齊巖等[18]對Rac1在鼻咽癌組織中的表達及預后做了相關研究。解娜等[19]闡述了Rac1對結腸癌細胞增殖的影響。張斌等[20]闡述了Rac1在腦膠質瘤干細胞遷移和侵襲中的作用。

本研究通過siRNA來干擾SRA01/04中Rac1的表達，提示Rac1不僅影響晶狀體上皮細胞的生長水平及增殖能力，還影響其細胞周期及遷移能力。由于血眼屏障的存在，人晶狀體內無血管，白內障術后殘存的晶狀體上皮細胞直接暴露于房水中，其生長、繁殖營養完全依賴房水。這也使得殘存的晶狀體上皮細胞所處的細胞外環境相對穩定，且相對易于體外培養模擬。因此，雖然本研究為體外細胞實驗，但其應用性及穩定性相對可靠。期待后續可以在動物實驗中進行前房內注射siRac1阻斷Rac1的表達，驗證其阻止PCO與CCS發生及發展的作用。

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（收稿日期：2018-04-20 本文編輯：張瑜杰）