巨噬細胞在腫瘤免疫治療中的研究進展①

支馨儀 劉巖厚 高 晶 王軼楠

(吉林大學第一醫院，吉林大學免疫學研究所，長春 130061)

巨噬細胞作為人體非特異性免疫的重要一員，在腫瘤侵襲、增殖、轉移中發揮作用[1]。一直以來，巨噬細胞被看做促進腫瘤生長轉移的幫兇，通過抑制其功能進行腫瘤免疫治療是主要的研究方向。近年來研究人員發現腫瘤中巨噬細胞被激活后具有顯著的抑癌效果，巨噬細胞又重新成為腫瘤免疫治療領域的研究熱點[2]。本文將從巨噬細胞促進腫瘤發生發展的作用及機制，以及恢復腫瘤部位巨噬細胞活性及功能在腫瘤免疫治療中的作用等方面加以綜述。

1 巨噬細胞促進腫瘤發生發展的作用及機制

在原發和繼發腫瘤中巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophage，TAM)，是腫瘤間質中細胞數量最多的群體，約占細胞總數的30%～50%。根據巨噬細胞的活化類型及其在腫瘤微環境中的不同作用，TAM主要分為M1型和M2型巨噬細胞：M1型巨噬細胞，即經典活化的巨噬細胞，可以高表達IL-12、IL-23、NO、活性氧分子(Reactive oxygen species，ROS)，具有溶解腫瘤細胞，向T細胞提呈腫瘤相關抗原，產生免疫刺激因子，促進T細胞和NK細胞增殖并強化二者抗腫瘤的作用；M2型巨噬細胞，即替代性活化的巨噬細胞，具有促進腫瘤形成和發展的作用，同時M2型巨噬細胞不能有效地提呈抗原，使T細胞的功能受到抑制[3]。

1.1腫瘤相關巨噬細胞增強腫瘤細胞的侵襲和增殖能力 TAM通過產生促炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、IL-6以及IL-11等，激活核因子-κB(Nuclear factor-κB)并促進轉錄激活子STAT3(The activation of signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)活化，增強腫瘤細胞的存活和增殖能力[4,5]。

集落刺激因子-1(Colony stimulating factor-1,CSF-1)在多種腫瘤細胞表面表達，與細胞表面受體CSF-1R結合后，受體構像發生二聚化，繼而磷酸化各種酪氨酸激酶殘基，引發信號級聯反應，最終導致腫瘤細胞增殖或分化[6]。腫瘤來源的CSF-1可以募集巨噬細胞歸巢，并促進巨噬細胞產生大量的表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)，MMP-9(Matrix metalloprotemases,MMP-9)，轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)，進一步增強腫瘤細胞的侵襲能力[7-9]。

1.2腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤血管生成的作用 TAM在調控腫瘤血管生成過程中起著關鍵作用，在多種腫瘤中如乳腺癌、葡萄膜黑色素瘤、神經膠質瘤、食管鱗狀細胞癌、膀胱癌、前列腺癌中TAM的數量與腫瘤部位的血管水平有密切關系[3]。在腫瘤缺氧的微環境中TAM會上調表達缺氧誘導的轉錄因子1和2(Hypoxia-inducible transcription factors，HIF-1，HIF-2)[10,11]。Barnett等[12]研究發現除了腫瘤干細胞外，TAMs也具有形成原始脈管網絡的能力，這些由TAMs所形成的管道在結構和功能上與動、靜脈，淋巴管有相似之處，被稱為擬態血管(Vascular mimicry，VM)。VM的形成與腫瘤微環境中缺氧狀態密切相關，當去除TAMs髓系特異性HIF-1基因時，會減少VM網絡的形成以及灌流情況，抑制腫瘤的生長。同時，TAM會高表達VEGF和其他促進血管生成因子的表達，而這些因子的產生主要依賴于HIF-1。

血管生成素Tie2也是當前研究熱點，Tie2是一種內皮細胞酪氨酸激酶受體，當與配體血管生成素結合后，維持血管內皮細胞動態平衡及存活狀態，促進血管分支形成[13]。過去認為Tie2只表達在內皮細胞上，最近的研究發現Tie2在單核細胞/巨噬細胞上也有表達，循環和組織中的單核細胞上表達量很少，但在腫瘤組織趨化下以及形成血管周圍巨噬細胞的過程中Tie2表達量顯著增高[14]。對小鼠乳腺癌(N202)細胞進行基因分析，發現Tie2+TAMs高表達腫瘤相關基因，包括MMP9、Vegfa、Cxcl12、Tlr4、Nrp1以及Pdgfb等。研究顯示Tie2+TAM能夠顯著促進腫瘤內血管生成，當去除Tie2+TAMs后，會使小鼠某些腫瘤如神經膠質瘤、胰腺癌以及乳腺癌中的血管生成和腫瘤生長受抑制[15]。

1.3腫瘤相關巨噬細胞促進腫瘤轉移的作用 在原發腫瘤部位中，TAM的數量越多預示著腫瘤發生早期轉移的可能性越高。在這一過程中需要來自巨噬細胞的EGF和來自腫瘤細胞的CSF-1之間相互作用，巨噬細胞分泌的EGF能夠使腫瘤細胞形成細長的突起并增強其侵襲能力，同時腫瘤細胞產生的CSF-1能夠促進巨噬細胞分泌更多的EGF，EGF反過來可促進腫瘤CSF-1的生成，由此產生正反饋環路，顯著提高腫瘤細胞的侵襲力，從而促進腫瘤發生轉移[7]。此外，實驗研究顯示TAM表達促進淋巴管生成的內皮生長因子-C(Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)，可能參與腫瘤細胞淋巴轉移的過程[16]。

在腫瘤肺轉移中，來自血小板微小凝塊中的腫瘤細胞會滯留在靶組織的血管中，從而使CCL2介導的Ly6C+單核細胞在該處聚集，并分化成為CCR2+VEGFR1+Ly6C-F4/80+轉移相關巨噬細胞(Metastasis-associated macrophage，MAM)，進而促進腫瘤細胞的轉移[17]。

Matthew F.Krumel研究團隊發現循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)進入肺部后，在毛細血管剪切流作用下動態生成腫瘤微粒。通過熒光譜系標記和流式細胞術，觀察到不同亞群的髓系細胞以不同方式作用于CTCs，形成腫瘤微粒，其中巨噬細胞在此過程中參與形成超過60%的腫瘤微粒。吞噬腫瘤微粒后的髓系細胞在肺間質中沿著成功轉移的腫瘤細胞聚集，促進存活下來的腫瘤細胞轉移，同時自身發生與吞噬腫瘤微粒相關的表型改變[18]。

1.4腫瘤相關巨噬細胞構成腫瘤免疫微環境，抑制其他效應細胞的抗腫瘤作用 腫瘤免疫抑制微環境中的IL-10、TGF-β1和PGE2能夠抑制巨噬細胞表面的MHC Ⅱ 類分子表達，從而使巨噬細胞不能有效地向T細胞提呈腫瘤抗原，阻礙T細胞對腫瘤細胞發揮特異性殺傷反應。除了腫瘤微環境的作用，TAM自身也可分泌IL-10、TGF-β并激活STAT3[17,19]。

TAM還可通過表達多種受體或者配體來發揮抑制功能，如表達精氨酸酶-1(Arginase-1，ARG-1)抑制T細胞的活性；或者通過表面高表達PD-1(Programmed cell death protein 1)，受體PD-L1和PD-L2促進腫瘤的免疫逃逸并使T細胞發生耗竭；表達T細胞共刺激調節受體配體B7-H4從而抑制T細胞活化等。TAM表面過表達抑制性受體(如CD94，ILT2/4)的配體HLA(HLA-C,E/G)，通過與T細胞表面抑制性受體ILT2/4結合抑制T細胞的增殖和功能發揮；通過Fas/FasL途徑誘導CD8+T細胞凋亡，亦能有效抑制CTL的免疫殺傷活性。TAM還可以通過與NK細胞表面的ILT2受體結合抑制NK細胞的殺傷功能；TAM過表達的吲哚胺2，3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase-1，IDO-1)可以廣泛抑制T細胞的功能并促進腫瘤血管生成[17,19,20]。

2 巨噬細胞在腫瘤免疫治療中的應用策略

近年來，基于T細胞的免疫治療取得了極大進展，但由于T細胞自身特點的限制，如不易趨化至腫瘤內部、抑制性受體在實體瘤環境下表達上調等，在治療實體瘤中療效不佳。針對腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤發生發展中的多種作用及機制，研究者通過多種手段和途徑試圖恢復或增強巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷能力，誘導腫瘤相關巨噬細胞向M1型轉化，以及促進其作為抗原提呈細胞對其他抗腫瘤效應細胞的活化能力，使得巨噬細胞重新成為腫瘤免疫治療研究和應用的重要成員。

2.1恢復或增強巨噬細胞的吞噬能力

2.1.1阻斷CD47/SIRP-α信號通路 CD47是目前研究恢復巨噬細胞抗腫瘤功能的重要分子。CD47幾乎表達于所有人類細胞的表面，巨噬細胞表面表達有CD47的受體信號調節蛋白α(Signal regulatory protein-α，SIRP-α)，二者結合可幫助巨噬細胞識別“本我”和“非我”細胞，而腫瘤細胞可以通過高表達CD47分子實現免疫逃逸[21]。研究者通過各種方式阻止腫瘤細胞表面的CD47分子與SIRP-α結合，從而修復巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬能力。

在動物實驗中，CD47抗體對于多種腫瘤均有顯著的治療效果。CD47抗體項目目前處于研發階段，全球共有3個CD47抗體項目處于Phase 1階段、1個處于IND階段、4個處于臨床前研究階段。處于Phase 1階段的三個藥物分別為Forty Seven公司的Hu5F9-G4、Celgene公司的CC-90002以及Trillium公司的TTI-621。值得注意的是，Trillium的CD47抗體項目為SIRP-αFc融合蛋白形式[22]。

除了應用單克隆抗體以及融合蛋白抑制CD47-SIRP-α通路外，Wang等[23]的實驗結果顯示運用RNA干擾技術敲除腫瘤細胞CD47分子后，巨噬細胞對腫瘤的清除能力得到有效增強。因此，他們建立了一種由脂質體-魚精蛋白-透明質酸包被anti-CD47-siRNA的納米顆粒遞送系統，經靜脈注射給荷載黑色素瘤的小鼠模型后，發現黑色素瘤的生長得到了有效的抑制。將該納米顆粒注射給小鼠肺轉移模型，結果顯示與對照組相比，實驗組中肺轉移的發生得到有效抑制，并且該納米顆粒不具有肝臟毒性，更適于臨床治療的應用。

2.1.2增強巨噬細胞介導的程序性細胞清除(Programmed cell removal，PrCR)作用 巨噬細胞介導的程序性細胞清除在腫瘤監視和清除過程中扮演著重要角色。Feng等[24]的研究結果顯示巨噬細胞的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)活化后，會激活下游的Btk(Bruton′s tyrosine kinase)信號通路，進而使內質網中的鈣網織蛋白(Calreticulin,CRT)發生磷酸化解離，解離后的CRT表達于巨噬細胞膜表面，形成CRT/CD91/C1q復合物介導巨噬細胞吞噬腫瘤。研究還發現，如果將TLR信號通路與抗CD47分子靶向治療結合后，可以顯著增強巨噬細胞對腫瘤細胞的PrCR作用。

2.1.3增強巨噬細胞介導的抗體依賴的吞噬作用(Antibody-dependent cell phagocytosis ,ADCP) 研究表明在依靠單克隆抗體治療腫瘤過程中，巨噬細胞不可或缺，主要發揮ADCP。用抗CD38分子的單克隆抗體Daratumumab(DARA)治療SCID-BEIGE小鼠白血病異種移植模型證實了這一抗腫瘤作用機制[25]。在另一項研究中顯示，接受抗CD142單克隆抗體的治療后，TAM表面表達FcγR并且能夠吞噬腫瘤細胞，當去除巨噬細胞后，會減弱抗CD142單克隆抗體的治療效果[26]。

2.1.4增強巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷毒性 研究人員通過體外特異性刺激活化的方式，如在體外培養巨噬細胞時加入巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor,M-CSF)，胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide,MDP)等，來增強巨噬細胞的細胞毒性，運用過繼轉輸的治療手段實現抗腫瘤作用；或者通過靜脈注射荷載免疫調節劑的脂質體增強巨噬細胞的殺傷活性[27]。Moyes等[28]通過基因改造的方式使巨噬細胞能夠分泌可溶性TGF-βRⅡ，中和免疫抑制性細胞因子TGF-β的功能，從而減少腫瘤免疫抑制微環境對巨噬細胞功能的抑制作用。微生物制劑和病原體來源的分子可以激發巨噬細胞的抗腫瘤細胞毒性，如應用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)治療膀胱癌[2]。在體外試驗中，BCG刺激巨噬細胞會增加巨噬細胞對某些膀胱癌細胞系的細胞毒性；此外，有證據表明BCG治療的膀胱癌患者尿液中IL-6、IL-12以及TNF含量增高，有可能與巨噬細胞的功能增強有關[29]。sialyl-Tn(sTn)是一種受唾液酸轉移酶ST6GALNAC1調控合成，并異常表達在膀胱癌細胞表面的O-linked糖鏈，Paula A.Videira和Fabio Dall′Olio的團隊在研究sTn是否參與BCG治療膀胱癌的免疫應答的過程中，構建了表達sTn的膀胱癌細胞系MCRsTn，發現BCG刺激可促進MCRsTn分泌IL-6和IL-8，這些細胞因子進一步刺激巨噬細胞產生大量的IL-6、IL-1β和TNF-α，增強巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的作用[30]。

2.2誘導腫瘤相關巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化 Daldrup-Link實驗室的研究人員將ferumoxytol(納米氧化鐵)與腫瘤細胞同時注射給乳腺癌模型小鼠后，發現與只接種腫瘤細胞的對照組小鼠相比，注射ferumoxytol組小鼠的腫瘤細胞生長速度受到明顯抑制。進一步研究發現，ferumoxytol和腫瘤細胞對巨噬細胞的募集有加和效應，此外，ferumoxytol可以促進巨噬細胞產生ROS，最令人興奮的是ferumoxytol可以促進巨噬細胞向M1型極化，M1型巨噬細胞可以產生過氧化氫，與鐵離子發生氧化反應后會產生高毒性的羥基基團，從而殺傷腫瘤細胞[31]。

臨床前研究發現，對荷載人神經膠質母細胞瘤的小鼠異種移植模型進行BZL945(一種小分子CSF-1R抑制劑)治療后，小鼠生存期限延長，腫瘤體積縮小并且生長速度減慢，同時由于使用CSF-1R抑制劑使得神經膠質瘤細胞產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)促進了TAM的生存，使TAM表面M2型標志表達減少，巨噬細胞的表型由促腫瘤的M2型向抗腫瘤的M1型轉變[32]。

許多針對CSF-1-CSF-1R通路的小分子藥物和抗體拮抗劑已經進入臨床前試驗中，例如emactuzumab(RG7155)，與CSF-1R結合后使受體無法形成二聚體，從而不能活化信號通路。研究顯示，應用emactuzumab治療可以減少TAMs的數量并且提高CD8+∶CD4+T細胞在腫瘤中所占的比例。此外，Pexidartinib(PLX339)是一種可以口服的CSF-1R抑制劑，其臨床第二階段的實驗結果顯示該藥物可以使腱鞘巨細胞瘤患者的病情得到緩解[33]。

2.3增強巨噬細胞提呈抗原能力，促進其他細胞抗腫瘤效應 Cai和Ma的團隊設計了一種對氧化還原反應和pH雙重應答的復合納米多肽載體。該載體的核心是由PLL-PLC[n-butylamine-poly(L-lysine)-b-poly(L-cysteine)]連接半乳糖組成Gal-PLL-PLC(GLC)，帶正電的PLL通過靜電吸引將miR155包裹其中，PLC通過巰基自身發生交聯形成氧化還原反應性二硫鍵增加納米顆粒的穩定性，半乳糖則可以提高TAM對納米顆粒的攝取能力，最后由連接DCA可卸載的PEG-PLL(sPEG)多聚物包裹形成sPEG/GLC納米顆粒。sPEG具有電荷可逆性，在生理pH條件下保護陽離子核心不受外界侵擾，但在腫瘤微環境的酸性條件下，則會暴露顆粒核心并釋放miR155。靶向TAM的miR155促使M2型巨噬細胞向M1型轉化，上調M1型巨噬細胞標志(如IL-12、iNOS、MHCⅡ)并下調M2型標志(如Msr2、ArgⅠ)的表達，此外還能促進T細胞和NK細胞的活化，從而發揮抗腫瘤效應[34]。

經過基因改造可大量產生IL-21的巨噬細胞通過增強NK細胞和T細胞的增殖以及殺傷活性，提高其抗腫瘤的作用[28]。Th1細胞在巨噬細胞抗腫瘤過程中起著重要作用，Th1細胞產生的細胞因子可以刺激巨噬細胞成為潛在殺傷腫瘤的效應細胞。研究顯示，在荷瘤小鼠局部注射或過繼傳輸低劑量輻照后的巨噬細胞，可以促進iNOS+M1巨噬細胞分化，使內皮細胞活化并產生Th1相關細胞因子，進而募集細胞毒性T細胞并通過iNOS殺傷實體腫瘤細胞[35]。

3 總結與展望

將TAM作為惡性腫瘤靶向治療目標的基礎研究和臨床前實驗在全球如火如荼地進行，一些結果顯示靶向巨噬細胞治療腫瘤確實具有莫大的應用潛力。但是在這一研究進程中，仍有如下需要解決的問題：(1)目前對于體內TAM發揮活性的分子機制尚不清楚，人類TAM自身的異質性加之腫瘤微環境的作用使得不同表型的TAM具有不同的功能，無疑增加了研究的難度。現階段的研究主要基于動物模型，實驗結果在人體中能否重復尚屬未知。

(2)將巨噬細胞作為抗擊腫瘤的效應細胞在治療過程中會伴隨很多副反應的發生。針對CD47分子利用mAbs發揮巨噬細胞ADCC/ADCP活性的前期研究中，CD47分子的封閉常會導致貧血的發生，此外，在紅細胞表面的CD47分子可以產生一個“抗原儲存庫”，這些抗原很容易與治療抗體結合，使治療抗體耗竭不能達到預期療效[22]。

(3)研究中的一個重要手段就是通過基因改造的方式增強巨噬細胞功能。這種方式雖然可以額外賦予巨噬細胞多種功能，但是插入外源基因后可能會增加巨噬細胞致瘤的風險，改造后的巨噬細胞由于功能增強還會產生細胞因子風暴，造成機體嚴重損傷。

(4)巨噬細胞由于受自身特性限制，輸注到體內后無法擴增，所以也限制其未來在臨床中的廣泛應用。Nico等選擇使用慢病毒載體將染色質開放組件(cbx3-UCOE)以及鋅指核酸酶介導的靶向表達盒插入人腺相關病毒整合位點1，從而使得誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPS)即使在成熟的CD14+單核細胞和CD11b+巨噬細胞中都能穩定持續地進行轉基因表達[36]。Senju等[37]用針對Amyloidβ和CD20分子的單鏈抗體修飾iPS-MP，分別與含有靶分子的細胞作用，觀察發現經單鏈抗體修飾后的iPS-MP能夠與靶分子特異性結合并發揮更強的吞噬作用。這一研究成果為體外擴增巨噬細胞開辟了新的道路。

(5)腫瘤相關巨噬細胞與腫瘤相關炎癥反應之間的關系同樣需要引起關注。除了巨噬細胞自身所形成的炎性反應環境外，腫瘤微環境中還存在其他細胞及活性物質造成的炎性反應，在這一微環境中，除了M1/M2極化型巨噬細胞外，還存在功能表型并不確定的腫瘤相關巨噬細胞，這些巨噬細胞的產生機制及生理功能等都需要進一步的深入探索[38]。

綜上所述，利用巨噬細胞抗腫瘤的研究已經取得了突破性進展，標志著與T細胞分屬于不同免疫體系的巨噬細胞將成為惡性腫瘤免疫治療新的研究對象和發展方向。

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