缺血性腦卒中在Wnt信號通路上與血管新生的研究概況

1.甘肅中醫藥大學， 甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省中醫院， 甘肅 蘭州 730050

腦卒中俗稱中風，是指由于急性腦血管血供障礙導致的局限或全面性腦功能缺損綜合征或急性腦血管病事件[1]。目前，腦卒中己成為嚴重威脅人類健康的重大疾病，在中國腦卒中發病率排名世界第一，近幾年流行病學統計，腦卒中年死亡人數達200萬，年增長率為8.7%，并且隨著人口老齡化的日益嚴重，這個數字還會隨著時間增加而增加。其中缺血性腦卒中占卒中患者的87%，是備受關注的重大疾病[2]。現在，神經科學研究的重要課題已經著眼于如何有效減輕腦缺血再灌注損傷和促進腦缺血后的再生反應。其中，再生反應中的血管新生是一種動態復雜的過程，由多種細胞因子和多種細胞成分參與[3]。近年來，關于腦血管發育的研究表明，Wnt信號通路在調節腦血管新生過程中起著至關重要的作用[4]。

1 缺血性腦卒中的發病機制

由于各種原因導致的局部腦組織血流量減少，區域組織供血障礙，導致病灶部位的神經元壞死而引起腦功能障礙[5]。其中梗死灶的可逆程度取決于閉塞動脈的大小和側支循環的有效建立，通過增加缺血半暗帶的血流灌注而恢復神經功能[6]。缺血導致血管內氧和葡萄糖供應減少，能量生成不足，細胞膜上ATP依賴的Na、K-ATP泵活性受到抑制，膜電位消失，Na+的內流和K+的外流使神經細胞發生去極化，同時，細胞間隙谷氨酸累積，NMDA受體和谷氨酸受體激活，細胞外的大量Ca2+內流，細胞內的鈣超載導致細胞結構發生破壞，大量自由基生成，該過程激活多條信號通路[7-8]。在缺血區域，雖然腦血流量只減少20 %，但是能量代謝和離子變化導致的缺血去極化發生的非常迅速，該過程使細胞快速死亡，其中致死區與正常區域的中間區域-缺血半暗帶的血流恢復就是決定是否發展為梗死灶的關鍵部位[9]。

2 缺血性腦卒中與血管新生

缺血性腦卒中患者的大腦缺血損傷部位病理學上可分為兩部分:一部分是不可逆的梗死腦組織區域，另一部分是處于缺血狀態但未完全梗死的區域，稱為缺血半暗帶(ischemic penurnbra,IP)。多數學者認為缺血半暗帶在缺血后1 h后出現，發展為最終梗死的時間窗為24 h,甚至可至48 h[10]。故在此動態發展過程中，在有效時間窗內恢復血流低灌注狀態促進血路再通可恢復為正常組織。所有缺血腦卒中治療的目的都是為了恢復缺血半暗帶的血流量，減少最終核心梗死區域面積的大小。根據其發病的病理生理特點，目前缺血性腦卒中的臨床治療主要是超早期溶栓、急性期神經保護及恢復期神經血管結構與功能的修復。但由于溶栓藥物的治療狹窄的時間窗以及對病人標準的嚴格篩查，絕大多數患者得不到有效救治；此外，雖已證實部分神經保護藥物在基礎研究中有效，但臨床應用中減少缺血性腦卒中患者大腦梗死面積和緩解由于卒中引起的致殘方面并未顯示出應有的療效。因此，恢復期神經血管結構與功能的修復逐漸得到越來越多的關注，目前有研究[11]表明缺血性腦卒中后內源性血管新生在改善腦組織功能中有重要作用，其新生成的血管可以增加缺血區腦組織的氧供和營養物質，挽救瀕危組織。故血管新生是治療缺血性腦卒中的潛在靶點，刺激血管新生可以作為治療缺血性腦卒中有效手段。

出生后的成體血管形成主要有兩種方式，分別為血管生成和血管發生。血管生成是指已經存在的血管上的現有的內皮細胞通過激活，沖破管壁基層，遷移、增殖和重構，出芽而生成新的血管網，向這種組織和器官輸送氧氣。這是組織生長和發育的正常生理過程，也是機體應對缺血損傷的應激反應。而血管發生是一種完全的血管新生的方式，當機體發生組織損傷后，通過內源性和外源性性的作用一系列誘導因子在一定時間內通過直接或間接的方式釋放到受損傷部位周圍，使骨髓中的EPCs轉移到外周血中，經過分化、遷移、增殖各步驟完成血管新生。EPCs是內皮祖細胞，既可以直接分化為內皮細胞參與血管生成的過程，同時也可以產生各種促進血管生成所需要的生長因子，而完成血管發生的過程[12]。有實驗[13]表明，在大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型中，梗死區域周邊的缺血半暗帶的EPCs在缺血后12～24 h內就分泌增加，3 d后血管密度與正常大腦血管密度比較明顯增加。Hayashi等[14]研究發現該過程持續時間甚至超過21 d。缺血性腦卒中的對中樞神經系統的損傷是源于損傷區局部腦血管血流的中斷和減少，因此該區域的血流再生修復對中樞神經系統的恢復也有極為重要的影響，EPCs作為影響血管新生的重要因子，它的數量可以作為內皮細胞修復的重要標志。HECHT N等[15]研究表明，用SD大鼠制作成腦缺血模型后，將骨髓EPCs移植到該模型中，可以增加毛細血管密度，促進血管新生。近年來，在治療血管新生的過程中，通過調節促血管生長因子，調控內皮細胞分化為血管已成為重點研究方向[16]。

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是直接或者間接介導血管新生的主要因子，來源于骨髓干細胞，是成熟血管內皮細胞的前體細胞，能定向分化為成熟的內皮細胞，動員和歸巢是EPCs參與缺血區域血管新生的關鍵部分[17]，在生理和病理的刺激下，骨髓中的EPCs應激性向外周血進行遷移，動員到外周血的EPCs分化為成熟EPCs并作用于損傷部位，而促進血管新生。影響EPCs動員的因素有內源性因素、外源性因素和某些藥物。內源性因素其中最主要的信號就是缺血，通過上調體內HIF-1α的水平[18-19]，使血管中的內皮生長因子(VEGF)表達增加，從而誘導骨髓中EPCs向外周血動員。某些細胞因子和趨化因子可以刺激骨髓中的EPCs向外周血中移動，與內源性因素一同促進血管新生。

內皮祖細胞區別其他細胞主要靠其表面標志物，包括CD34、CD133、VEGER-2等。CD34是1997年ASAHARA等[20]首次從人外周血單核細胞中分離出來，是一個重要的造血干細胞表面標志物，也是早期胚胎血管的表面標記，是識別EPCs的重要標志之一。從骨髓和外周血中提取的細胞促進血管新生，并迅速分化為體內內皮細胞。CD133在1977年被作為一種表面抗原而發現，在線蟲的干細胞中表達，而不是在成熟內皮細胞或單核細胞中。VEGER-2是成熟內皮細胞中最常表達的標記，也表達在循環的內皮細胞上。它來源于造血干細胞，具有繁殖和釋放生長因子的能力[21]。這些聯合表達干細胞的表面標志物被認為表達特有表面抗原CD34+、CD133+、VEGER-2+的細胞在體內外具有分化成為成熟內皮細胞的能力[22]。現通常采用CD34+作為鑒別EPCs的標志。研究報道，Kocher等[23]給無胸腺的大鼠造成心梗模型后注射在體外擴增后的CD34+細胞，結果證實模型缺血區毛細血管密度明顯高于對照組，血管新生數量明顯增加。

3 Wnt信號通路

Wnt通路是一條研究的較成熟的信號通路，Wnt通路上的蛋白與靶細胞表面特異性受體相互作用，導致細胞內的一系列反應，進而參與對胚胎干細胞的增殖、分化、凋亡等病理生理的調控，建立細胞的極性[24]。

Wnt信號通路分為經典Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路，經典Wnt信號通路因其下游信號受β-catenin調控，故稱為Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin作為核心分子在該通路上起重要調節作用。非經典Wnt信號通路又稱為β-catenin非依賴性通路，Wnt信號通路由配體蛋白、細胞膜表面相應受體及細胞質內信號物質構成。Wnt蛋白家族中包括19種蛋白亞型，是一種分泌型蛋白家族，由350～400個氨基酸對其編碼，其中有24個保守的半胱氨酸。按照通路不同，Wnt蛋白分為兩型，經典Wnt信號通路(β-catenin)蛋白為Wnt-1族，包括Wnt1、Wnt3a、Wnt8a等；非經典Wnt信號通路蛋白為Wnt-5a族，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt7b等[25]。

3.1 經典Wnt信號通路 經典Wnt信號通路是血管生成的重點調節通道，主要是細胞外Wnt配體與細胞膜上的受體結合，提高細胞質內β-catenin蛋白的穩定性，促進其移位至細胞核，激活下游靶基因的表達。β-catenin在細胞核的累積受到其蛋白穩定性、入核、出核等多個層面的調控，是Wnt信號通路的關鍵因子。氯化鋰(Licl)是一個典型的Wnt信號通路激活劑，通過抑制了糖原合成酶激酶-3β從磷酸化的β-catenin鏈中生成，從而導致了活性β-catenin鏈肽的積累，這些多肽鏈轉移到細胞核中，從而激活信號因子，如Tcf/Lef，與該信號因子結合后，最終激活與細胞增殖、分化相關的下游靶基因的表達。然而，dickkopf-1(DKK-1)是一種典型的Wnt受體，它與Wnt受體的低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6(Irp5/6)結合，從而抑制了一個模板受體復合物的產生，起到阻止β-catenin的信號傳導。所以，在激活劑(Licl)的刺激下，在細胞質聚集的β-catenin促進其轉位到細胞核，結合聯合因子Tcf/Lef-1來刺激基因轉錄，而Wnt受體DKK1與Irp5/6結合，使β-catenin信號封鎖，在核轉位上的顯示很少。實驗[26]表明，在大鼠腦缺血發生時，Wnt信號通路中的抑制劑DKK-1在缺血區和缺血半暗帶區被抑制生成，表達水平降低，從而增加Wnt/β-catenin信號通路的活性，內源性的促進血管新生，減輕因缺血對腦組織的損傷。故經典Wnt/β-catenin信號通路參與了缺血性腦卒中發生后血管新生和對神經功能保護的過程。

3.2 非經典Wnt信號通路 Wnt還可以通過刺激其他受體激活非經典Wnt信號通路。包括平面細胞極性通路和Wnt/Ca依賴通路等。Wnt/Ca通路目前普遍認為是通過Wnt5a和Wnt11激活G蛋白，進而刺激PLC和PKC分泌，從而引起細胞內Ca2+濃度增加和Ca敏感信號激活，增加細胞運動和細胞粘著性[27]。并且，Wnt/Ca信號通路可以激活Ca MKII進而活化轉錄因子β活化激酶1(TAK-1)，使Wnt受體的低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6(Irp5/6)磷酸化，阻止β-catenin的聚集。Wnt/JNK信號通路是Wnt配體激活JNK和ROK通過GTPase/Rho A中介，然后激活的JNK和ROK進入細胞核，與轉錄因子c-Jun和ATF2結合后進一步調節基因的表達。

4 血管新生與Wnt信號通路

有研究[28]表明，Wnt蛋白存在于血管中，是參與腦血管生成的重要調節介質，激活或抑制Wnt信號通路對胚胎或成體血管生成都可以起到一定控制和調節作用。故通過調節Wnt信號通路上的蛋白而增加血管新生已成為現在治療缺血性腦卒中的研究熱點。血管細胞通過該通路對Wnt信號作出反應，血管生成的過程遵循了Wnt/β-catenin信號通路的基本調控原則，該通路在血管生成、血管重塑和分化的許多方面都有涉及；還包括血管的出芽，血管網的成熟[29]。除了經典Wnt信號通路，非經典通路對血管新生的過程中也發揮著重要調控作用，對不同時期的形成既有正調控作用，也有負調控作用，經典Wnt通路主要通過刺激血管中存在的Wnt蛋白，與細胞上受體結合后，使細胞質內β-catenin轉移到細胞核，激活下游靶基因，從而促進血管內皮細胞的表達，新生血管數量增加。非經典Wnt信號通路中Wnt/Ca通路主要通過鈣依賴激酶、鈣調節蛋白和轉錄因子N-F-AT起作用。激活Wnt/Ca通路可以導致細胞內Ca2+釋放，從而激活Ca MKII，Ca MKII被認為是Wnt/Ca通路中的關鍵蛋白[30]。有實驗[31]表明，Wnt配體(Wnt1 ，Wnt3a ，Wnt5 a 和Wnt7 b) 可以促進EPCs的增殖而促進血管新生，阻斷Wnt/β-catenin信號通路將會影響血管新生[32]，表現在毛細血管數量減少，毛細血管床喪失等方面。研究表明[33]，促進血管新生的相關因子是Wnt/β-catenin信號通路上的靶基因，用氯化鋰(Licl)激活Wnt信號通路后，生長因子的表達上調；而用抑制劑DKK-1后，血管新生的相關因子表達明顯下調。故說明，經典Wnt信號通路與非經典Wnt信號通路起到協同調控作用，共同調節缺血性腦卒中發生后血管新生的調控。

5 展望

目前，缺血性腦卒中已成為最主要的致死因素和致殘因素，并且隨著中國老齡化的增加，其發病率、致殘率、死亡率和復發率都持續升高，嚴重威脅著人類的生命，影響著生存質量。所以臨床治療缺血性腦梗死為重中之重，其主要治療的超早期溶栓，因狹窄的時間窗以及對患者標準的嚴格篩查，并不能對患者進行有效治療，因此神經血管結構與功能的修復已得到越來越多的關注。及時恢復缺血半暗帶的血流，促進血管生成，提供給缺血區腦組織足夠的氧供和營養物質，保護神經元細胞是治療缺血性腦卒中的有效手段。研究Wnt信號通路與血管新生的作用可為治療缺血性腦卒中提供新的治療思路。