剩余胚胎養囊后凍融囊胚臨床結局分析

詹 玲，易曉芳，羅 偉

（三峽大學仁和醫院生殖中心，湖北 宜昌 443001）

目前大多數生殖中心評價胚胎移植的標準主要還是形態學評分，但隨著囊胚相關技術的逐漸成熟完善，新鮮周期移植冷凍后剩余的胚胎繼續培養至囊胚期，再行冷凍已成趨勢，且這一方法的臨床價值和結局已引起諸多學者的關注和研究。已有相關文獻多次報道[1，2]，D3低形態學評分的胚胎在體外繼續培養有部分胚胎能發育成優質囊胚，說明這一部分胚胎依然具有不同程度的發育潛能。這也引起大家對于移植胚胎選擇標準的重新審視，如何更全面地評估移植胚胎將是生殖學者亟需解決的難題。

本研究回顧性研究新鮮周期中D3移植冷凍優質胚胎后剩余胚胎的發育情況，選擇合適囊胚行玻璃化冷凍，擇期行凍融胚胎移植。分析比較D3優質卵裂胚胎和D5、D6凍融囊胚移植后的臨床結局，探討剩余胚胎繼續培養至囊胚的臨床應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2013年1月～2015年11月常規IVF/ICSI治療周期中D3對優胚行移植或冷凍（最多不超過6個），剩余胚胎（患者已簽署知情同意書）繼續培養，對形成的囊胚進行評級，選擇符合標準的囊胚行玻璃化冷凍。收集2015年1～2015年11月在本中心行囊胚解凍的患者106個周期，這些囊胚均由新鮮周期中剩余胚胎形成，解凍后培養2小時觀察囊胚擴張后進行移植。2015年1～2015年11月本中心行D3卵裂期凍融胚胎移植的患者186個周期。

1.2 試劑和耗材

1.2.1 D3胚胎評分標準

I級：胚胎卵裂球均勻，胞質清晰，碎片＜5%；

II級：胚胎卵裂球均勻，碎片＜20%；

III級：胚胎卵裂球均勻或不均勻，碎片＞20%；

IV級：胚胎卵裂球嚴重不均勻，碎片＞50%。

注：D1正常受精來源的6～10細胞的I和II級胚胎為優胚，可以移植或冷凍。

1.3 剩余胚胎

包括D3非優胚、所有D1非正常受精來源（0PN和1PN）以及小部分優胚（D3優胚＞6）。

1.4 冷凍囊胚標準

參照Gardner囊胚評分標準[3]將囊胚發育分為6級，1級：早期囊胚，囊腔體積小于總體積50%；2級：囊胚腔體積大或等于總體積50%；3級：囊胚腔幾乎占滿整個胚胎；4級：囊胚腔進一步擴大，透明帶變薄；5級：正在孵化的囊胚；6級：囊胚完全孵出。內細胞團分級：A級：細胞數目多，排列緊密；B級：細胞數目較少，結合較松散；C級：細胞數目極少。滋養層細胞分級：A級：上皮細胞層細胞數目多，結構致密；B級：上皮細胞層細胞數目較少，結構松散；C級：上皮細胞層細胞稀疏。將D5或D6評分≥4CB的囊胚予以冷凍。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，計數資料采用x2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 囊胚形成情況對新鮮周期妊娠結局的預測

2015年本中心新鮮周期798個，新鮮周期移植冷凍后有繼續培養周期451個，繼續培養胚胎數2277枚，形成囊胚1441枚，囊胚形成率63.3%，冷凍囊胚940枚，囊胚冷凍率41.3%。新鮮周期中有繼續培養的周期臨床妊娠率明顯高于無繼培周期；其中有繼培周期中，有囊胚冷凍的周期相比無囊胚冷凍周期，臨床妊娠率明顯升高，結果均有顯著性統計學差異；差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 新鮮周期與無繼培周期比較

2.2 剩余胚胎養囊后凍融囊胚與D3凍融胚胎臨床結局比較

2015年1～2015年11月在本院生殖中心由新鮮周期移植冷凍后剩余胚胎發育的囊胚復蘇移植的患者共106個周期188枚囊胚，其中D5囊胚解凍52個周期94枚胚胎，復蘇率97.9%，D6囊胚解凍55個周期94枚胚胎，復蘇率92.6%，兩者復蘇率沒有統計學差異。D3凍融胚胎解凍186個周期381枚胚胎，復蘇率99.0%，與D6囊胚復蘇率有統計學差異；差異有統計學意義（P＜0.05）。與D3凍融胚胎相比，凍融囊胚平均移植胚胎數明顯減少，而臨床妊娠率和種植率明顯升高，且流產率和異位妊娠率也明顯降低。其中D5與D6相比，種植率和雙胎率有統計學差異，差異有統計學意義（P＜0.05）；D5與D3相比，臨床妊娠率和種植率有統計學差異，差異有統計學意義（P＜0.05），其他比較均沒有統計學差異。見表2。

2.3 D5與D6凍融囊胚移植數目不同及其臨床結局比較

106個凍融囊胚周期其中有35例單囊胚移植，將不同移植數目的D5與D6凍融囊胚之間相互比較，臨床妊娠率和種植率均無統計學差異。見表3。

表2 剩余胚胎養囊后凍融囊胚與D3凍融胚胎臨床結局比較

表3 D5與D6凍融囊胚移植數目不同及其臨床結局比較

3 討 論

隨著試管嬰兒技術的不斷發展，原核期評分和卵裂期形態評分已經不能完全反應胚胎的發育潛能[7]。但是若全部進行囊胚培養，導致可利用胚胎減少，周期取消率增加，因此目前大多數生殖中心依然以移植D3胚胎為主。通過繼續培養剩余胚胎，冷凍有發育潛能的囊胚可提高胚胎利用率。

本中心結果顯示繼續培養胚胎2277枚，形成囊胚1441枚，冷凍囊胚940枚，囊胚形成率63.3%，，囊胚冷凍率41.3%。說明D3剩余胚胎確實具有相當大的發育潛能。本實驗結果比戴志俊等[2，4]人報道的低等級或非優質胚胎繼續培養結果囊胚形成率和囊胚冷凍率均要高，分析原因可能與本實驗室納入繼培胚胎較嚴格和冷凍囊胚標準較寬有關系。本實驗室D3剩余胚胎主要是D3非優胚，所有D1非正常受精來源（0PN和1PN），還有一部分移植冷凍后剩余優胚，D3冷凍胚胎最多不超過6個，因此優胚較多的患者會有一部分優胚納入繼續培養。其次，本中心囊胚冷凍標準較寬，只要是內細胞團達到B級或者滋養層達到B級就考慮冷凍。但是我們的臨床結果表明，確實有一部分評分較差的囊胚依然可以獲得臨床妊娠，一方面不同生殖中心評價囊胚的主觀性不同，另外囊胚腔的擴張會遮擋一部分內部形態而誤導囊胚評分，因此我們會綜合評價激光破膜后囊胚的塌陷情況再冷凍。

本研究中通過繼續培養剩余胚胎形成囊胚，行凍融囊胚移植后得到了較好的臨床妊娠率，甚至比D3凍融優胚結局更好，差異有統計學意義（P＜0.05）；凍融囊胚的平均移植胚胎數明顯減少，尤其是D5凍融囊胚的種植率和雙胎率都接近50%，對于部分情況較好且有優質囊胚的患者可以考慮單囊胚移植。研究者[8]發現凍融D5囊胚臨床妊娠率要高于D6的囊胚，本研究結果中D5與D6妊娠率沒有統計學差異，但D5凍融囊胚的種植率和雙胎率明顯高于D6且有統計學差異；差異有統計學意義（P＜0.05）。結果有異于許麗娟等[5]人的結果，可能與本中心評價冷凍囊胚的標準較寬有關。本實驗結果沒有篩選患者的基本情況，還需加大樣本量繼續研究。凍融囊胚的異位妊娠率和流產率均明顯低于D3凍融胚胎，結果與Cong Fang[6]等人一致。

目前很多生殖中心都采用單囊胚移植，移植胚胎數少，降低雙胎率，并維持較高水平的臨床妊娠率。但大部分生殖中心依然常規移植2枚囊胚。表3結果顯示移植數目不同，妊娠結局無明顯不同，D5與D6之間臨床妊娠率均無統計學差異。提示可根據囊胚質量選擇性單囊胚冷凍。另外，本中心的35例單囊胚移植中（其中D5有12例，D6有23例），妊娠17例，這些囊胚幾乎全部由非優胚形成，且有一部分囊胚評分較低，卻依然可以使患者獲得臨床妊娠，說明不管是卵裂期還是囊胚期的形態學評分均不能完全評價胚胎的潛力，一部分低評分卵裂胚和囊胚依然具有較好的發育潛能。將這一部分D3剩余胚胎用于囊胚培養，可提高胚胎利用率。對于一些沒有優胚移植或移植優胚依然不孕的患者，可移植剩余胚胎形成的囊胚。囊胚質量不同、移植數目不同其妊娠結局存在差異，如何根據患者的情況選擇最佳移植方案將成為生殖學家的另一熱點。

[1] Lerou PH,Yabuuchi A,Huo H,et al. Derivation and maintenance of human embryonic stem cells from poor-quality in vitro fertilization embryos[J].Nat Protoc,2008,3(5):923-933.

[2] 戴志俊,鄒林兵,汪凌云,等.非優質卵裂胚胎繼續培養至囊胚的臨床應用研究[J].中國優生與遺傳雜志,2015,05:118-119.

[3] 黃國寧,孫海翔.體外受精-胚胎移植實驗室技術[M].人民衛生出版社,2012.

[4] 莫美蘭,宋 成,張宏展,等.低等級胚胎繼續培養的價值與其臨床結局[J].生殖醫學雜志,2012,03:205-208.

[5] 許麗娟,陳 薪,田小龍,等.非優良胚胎形成的囊胚與卵裂期優良胚胎的凍融胚胎移植的臨床結局比較[J].南方醫科大學學報,2015,04:481-485.

[6] Fang C,Huang R,Wei LN,et al.Frozen-thawed day 5 blastocyst transfer is associated with a lower risk of ectopic pregnancy than day 3 transfer and fresh transfer[J].Fertility and sterility,2015,103(3):655-661.

[7] Ren X,Liu Q,Chen W,et al.Selection and vitrification of embryos with a poor morphological score:a proposal to avoid embryo wastage r[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2012,32(3):405-409.

[8] 賈 磊,岳超敏,宮 曉,等.移植復蘇周期第5日和第6日凍融囊胚發育潛能的比較[J].新醫學,2013,11:748-751.