南燭多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

徐廣洲

【摘 要】以南燭嫩葉為原料，粗制南燭多酚氧化酶（PPO）酶液，采用硫酸銨鹽析、透析袋透析的方法，對(duì)南燭多酚氧化酶進(jìn)行初步純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：南燭多酚氧化酶的最適pH為6.5，最適溫度為45℃左右，最適底物為鄰苯二酚，本實(shí)驗(yàn)為南燭黑色素的制備提供了一定的參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】南燭；多酚氧化酶；酶學(xué)性質(zhì)

南燭（Vaccinnium Bracteatum Thunb）屬于杜鵑花科越橘屬，在江浙、福建、湖廣一帶，人們以其莖葉浸漬染米加工烏飯。南燭黑色素作為一種植物來(lái)源的黑色素，安全性高，受到廣泛關(guān)注。魏國(guó)華等學(xué)者提出南燭黑色素的形成可能與酶相關(guān)[1-2]，王敬文等人在制備南燭黑色素的過(guò)程中，加入一定量的多酚氧化酶或其它類型的酶，得到了顏色更黑的南燭葉黑色素提取液[3]。多酚氧化酶是一種含銅的金屬酶，可以用一元酚和二元酚作底物，是發(fā)生酶促褐變的主要酶，存在于大多數(shù)果蔬細(xì)胞組織中。本文對(duì)南燭葉中的多酚氧化酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)行初步探究，為南燭黑色素的制備提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、曲通拉X-100、硫酸銨、聚乙烯吡咯烷酮、L-多巴、鄰苯二酚、L-酪氨酸、綠原酸、愈創(chuàng)木酚、兒茶素、焦性沒(méi)食子酸。透析袋（分子量：14400）；可見分光光度計(jì)；冷凍離心機(jī)；磁力攪拌器；pH計(jì)；紫外探頭型可見光譜儀；電熱恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗制酶液

取適量新鮮南燭嫩葉，加入磷酸鹽緩沖液（0.1 M，pH6.5），料液比1：5，加入1 %聚乙烯吡咯烷酮以及0.25%的曲通拉X-100，低溫勻漿30min，離心（10000rpm，5min，4℃）取清液，即為粗制酶液，4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 酶活性的測(cè)定

分光光度計(jì)比色法：2.0ml的磷酸鹽緩沖液 （0.1M）和0.9ml的鄰苯二酚（0.01M）的混合液，0.1ml酶液，恒溫5min，混勻，迅速測(cè)定反應(yīng)體系在420nm吸光度變化，以最初直線段的斜率計(jì)算酶活力?？瞻讓?duì)照：鄰苯二酚溶液/磷酸鹽緩沖液的混合液。PPO酶活性的定義：每分鐘吸光值（420nm）變化0.001定義為1個(gè)酶活力單位，及1U，PPO酶活性表示為103×A420/min[4]。

1.2.3 分離純化

粗酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到20%，4℃下靜置4h，然后在10000rpm/min、4℃條件下離心10min，分離沉淀物。將鹽析得到的蛋白溶于0.01M磷酸鹽緩沖液后，透析除鹽，于4℃透析24h，每4h更換透析液[5]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行2個(gè)重復(fù)，利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)南燭PPO酶活性的影響

以鄰苯二酚為底物，研究pH對(duì)酶活性的影響，配制不同pH的磷酸鹽緩沖液，構(gòu)建不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的反應(yīng)體系，37℃測(cè)定酶活，以各pH條件下測(cè)得的最高酶活作為100%計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果如圖1所示。pH對(duì)南燭葉PPO的酶活性影響非常明顯：在pH值3.5-5.5的之間，隨著pH值升高，南燭葉PPO酶活性先升高后降低，在pH值為4.5時(shí)酶活性較大；pH值繼續(xù)變大，PPO的酶活力出現(xiàn)相同變化，但酶活性增強(qiáng)，pH值為6.5時(shí)酶的活性最高。因此，以鄰苯二酚為底物時(shí)南燭葉PPO酶的最適pH為6.5。

2.2 溫度對(duì)多酚氧化酶活性的影響

以鄰苯二酚為底物，研究溫度對(duì)PPO活性的影響。在pH 6.5條件下，在不同溫度（5、15、25、35、45、55 ℃）條件下，以各溫度條件下測(cè)得的最高酶活作為100 %計(jì)算相對(duì)酶活（圖2）。在15℃-45℃之間，PPO活性隨溫度升高而增加；在45℃-65℃之間，多酚氧化酶活性隨溫度升高而下降；以鄰苯二酚為底物，在pH6.5條件下，45℃左右時(shí)南燭葉多酚氧化酶表現(xiàn)出最大酶活性。

2.3 PPO酶的米氏常數(shù)

用磷酸鹽緩沖液（pH6.5）分別配制濃度為5、10、20、50、100mM的底物溶液，分別測(cè)定不同底物在不同濃度條件下的酶活反應(yīng)初速度，并采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計(jì)算底物的Km、Vm值[4]，結(jié)果如表1所示。由結(jié)果可知，兒茶素對(duì)南燭葉多酚氧化酶的Km值最小，有最好的親和力，但綜合考慮Vmax/Km的值大小，南燭葉多酚氧化酶最合適的底物為鄰苯二酚。

3 討論

由于酶的大多數(shù)為蛋白質(zhì)，凡能影響蛋白質(zhì)的理化因素都可能影響酶的結(jié)構(gòu)與功能，影響酶促反應(yīng)的因素主要有底物、pH、溫度、抑制劑及激活劑等。首先酶在催化反應(yīng)時(shí)，對(duì)于底物有嚴(yán)格的選擇性，只有酶的活性中心與底物契合的時(shí)候，才會(huì)發(fā)生酶促反應(yīng)；其次PPO是一種含銅酶，強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿條件都可能會(huì)導(dǎo)致Cu2+的解離以及蛋白質(zhì)的變性，從而降低PPO的活性；酶作為催化劑，隨著反應(yīng)溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，單位時(shí)間內(nèi)底物與酶接觸的幾率上升，酶活性增大，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，酶蛋白的變性程度不斷加深，導(dǎo)致其催化能力的喪失。對(duì)比牛蒡、蘋果、梨和蓮藕 PPO[4，6，7，8]等主要酶學(xué)特性發(fā)現(xiàn)：鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸及L-多巴是普遍適合的底物，而酪氨酸，愈創(chuàng)木酚等一元酚不是這些PPO的適合底物；最適pH大多在6.0-7.4范圍；最適溫度大多在20-40℃范圍。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，南燭多酚氧化酶的最適底物為鄰苯二酚，對(duì)其酶促反應(yīng)的最適pH為6.5，最適溫度為45℃。這些都為南燭黑色素的制備和南燭葉多酚氧化酶的實(shí)際應(yīng)用提供了一定的參考。本文只是研究了南燭多酚氧化酶部分酶學(xué)性質(zhì)，還可以進(jìn)一步研究其他底物、抑制劑和激活劑對(duì)南燭葉多酚氧化酶的影響。

【參考文獻(xiàn)】

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