結腸癌患者SIRT6表達與病理特征的相關性

耿長輝 張春玲 曹珍珍 衣洪天 何苗 黃樹民 菅晶晶 高萍

結腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，發病率高，隨著手術、化療、分子靶向治療的發展，結腸癌患者近期生存質量得到一定程度改善，但5年遠期生存率仍不理想［1］。轉錄因子和信號通路在結腸癌病理進程中發揮重要作用，Sirtuin蛋白屬NAD＋依賴性組蛋白去乙酰化酶，既往報道證實Sirtuin蛋白可通過調控轉錄因子和信號通路，參與腫瘤細胞DNA修復、細胞增殖及凋亡過程［2］。去乙酰化酶（Sirtuin6，SIRT6）是Sirtuin蛋白的重要成員，有研究顯示SIRT6蛋白與肝癌發生發展密切相關，但有關其在結腸癌中的報道尚屬少見［3］。本研究納入60例結腸癌患者作為研究對象，分析SIRT6表達與結腸癌病理特征的相關性，并對其可能的機制做初步探討，為臨床分子靶向治療提供參考。報道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2015年4月至2017年4月哈爾濱醫科大學附屬第五醫院普外科60例結腸癌患者作為研究對象。納入標準：（1）均經組織病理活檢和結腸癌根治術確診；（2）入院前未接受放化療、內分泌、手術干預及其他治療；（3）均獲得患者同意并簽署知情同意書。排除標準：（1）病歷資料缺失者；（2）合并有其他惡性腫瘤者。60例患者中男32例，女28例；平均年齡（54.31±12.86）歲；腫瘤位置：乙狀結腸17例，降結腸27例，升結腸16例；腫瘤直徑（4.27±1.82）cm；分期Ⅰ期17例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例；高分化16例，中分化25例，低分化19例。

二、研究方法

1.Western blot法檢測 SIRT6和HIF-1α：（1）設備試劑：顯微鏡為日本Olympus公司提供的SZ51/SZ61型光學顯微鏡，MK3酶標儀由上海賽摩科技生物發展有限公司提供。考馬斯亮蘭蛋白試劑盒由上海斯信生物科技有限公司提供，兔抗人SIRT6和缺 氧 誘 導 因 子 1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）多克隆抗體均由英國Abcam公司提供，超敏ECL化學發光試劑盒由北京科宇深藍科技有限公司提供；（2）標本采集：均取手術切除的結腸癌組織和癌旁組織標本，癌旁組織標本應距病灶邊界5 cm以上，將標本浸泡于10%甲醛溶液12 h后，石蠟包埋切片，4 ℃保存；（3）檢測方法：取0.3 cm3樣本，以1：5比例依次加入適量Trizol試劑和氯仿。離心后取上層含RNA的水相層，再次離心，去上清液，室溫下風干，于-80 ℃保存。采用考馬斯亮蘭蛋白試劑盒，并利用標準曲線計算蛋白含量。根據蛋白分子量大小配制聚丙烯酰胺分離膠和基層膠，加入適量Marker蛋白，給予80 V/h電泳電壓，待樣品溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電泳增至110 V/h，當溴酚藍的藍色至分離膠底部時，結束電泳。參照跑膠大小，對濾紙和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜進行裁剪，并將PVDF膜和濾紙浸泡于緩沖液中，將凝膠、PVDF膜置于濾紙間，使各層間無氣泡，在65 V/h電流條件下進行電轉，2 h后停止。將PVDF膜封閉于5%牛奶封閉液中，孵育1 h后去封閉液，洗滌。將洗滌后的PVDF膜移至一抗溶液，4 ℃孵育過夜。去孵育抗體，用TBST漂洗液洗滌濾膜3次，5～10 min/次。取洗滌后的PVDF膜，再次進行二抗，操作同上。完成后將PDVF膜置于ECL中，曝光顯影。

2.免疫組化法檢測SIRT6：取結腸癌組織石蠟切片，依次取二甲苯、無水乙醇、乙醇及PBS溶液進行脫蠟處理，用3% H2O2滅活內源性氧化酶后，取出切片，再用PBS溶液洗滌3次，5 min/次，采用微波修復法修復抗原，將切片移至枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱至沸騰后冷卻，重復1次后用PBS洗滌，取切片，封閉10 min。在切片組織中加一抗，4 ℃條件下孵育12 h，洗滌取出后加入二抗，4 ℃下孵育20 min，洗滌后在切片上加適量二氨基聯苯胺顯色液，在顯微鏡下取高倍視野（×200）觀察切片組織顏色。

三、觀察指標

根據Western blot法檢測結果記錄結腸癌組織和癌旁組織中SIRT6和HIF-1α蛋白表達水平，入院時收集患者性別、年齡基本病例資料，根據手術結果納入腫瘤位置、直徑、TNM分期及分化程度等病理資料，分析SIRT6和病理特征、HIF-1α的關系。根據免疫組化顯色結果判斷SIRT6蛋白性質［4］，定位于細胞核，陰性：視野內棕黃色腫瘤細胞＜20%，陽性：視野內棕黃色腫瘤細胞≥20%。

四、統計學分析

選用SPSS19.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數資料以（%）表示，組間比較行χ2檢驗，多因素采用Logistic分析，相關性采用直線線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Western blot法檢測SIRT6蛋白和HIF-1α表達情況

結腸癌組織中SIRT6和HIF-1α分別為（1.87±0.65）和（1.72±0.59），癌旁組織中SIRT6和HIF-1α分別為（2.34±1.13）和（0.84±0.36），兩組間比較差異顯著（t=2.793，9.862；P=0.006，0.000）。見圖 1～4。

二、不同病理特征患者SIRT6蛋白表達差異

60例患者結腸癌組織經免疫組化檢測SIRT6蛋白陽性13例，陰性47例，SIRT6不同表達水平患者間腫瘤分期和分化程度差異顯著（χ2=7.651，9.346；P=0.022，0.009）。見表 1，圖 5～6。

三、SIRT6蛋白表達多因素分析

將差異有統計學意義的指標賦值并納入多因素分析模型，賦值如下：分期（Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2），分化（高分化=0，中分化=1，低分化=2）。經多因素分析顯示腫瘤分期是影響SIRT6蛋白表達水平的獨立因素（P＜0.05）。見表2。

四、Western blot法檢測SIRT6和HIF-1α蛋白表達相關性分析

結腸癌患者癌組織中SIRT6蛋白表達與HIF-1α水平呈顯著負相關性（r=-0.819，P=0.000），見圖7。

圖1 Western blot法檢測SIRT6/β-action 圖2 Western blot法檢測HIF-1α/β-action 圖3 SIRT6在結腸癌和癌旁組織中表達 圖4 HIF-1α在結腸癌和癌旁組織中表達

表1 不同病理特征患者SIRT6表達差異（例，%）

討 論

國內有報道顯示結腸癌發病率居惡性腫瘤第4位，且呈年輕化趨勢［5］，既往報道顯示癌胚抗原、癌抗原125、基質金屬蛋白酶-2及磷脂酰肌醇激酶-3等分子標志物與結腸癌關系密切，但上述標志物缺乏特異性，均不能用于指導結腸癌分子靶向治療［6-8］。SIRT6是Sirtuin蛋白的重要成員，具有去乙酰環酶和ADP-核糖基轉移酶催化活性作用，可與抑癌因子泛素特異性蛋白酶10協同作用，抑制腫瘤細胞增殖分化，對腫瘤細胞的基因表達、DNA修復及生產代謝過程均具有重要的調節作用［9-11］。

圖5 SIRT6在結腸癌組織中陰性表達（×10）圖6 SIRT6在結腸癌癌旁組織中陽性表達（×10）

表2 SIRT6蛋白表達多因素分析

圖7 SIRT6和HIF-1α相關性分析

本研究采用Western blot法檢測結腸癌和癌旁組織中的表達，發現癌組織中SIRT6蛋白表達水平顯著低于癌旁正常組織，提示結腸組織中SIRT6蛋白表達水平降低可能存在癌變風險，動物實驗顯示敲除SIRT6蛋白后小鼠腫瘤數量和大小增加，侵襲性增強［12］，提示SIRT6蛋白對結腸癌進展可能存在保護作用，說明SIRT6蛋白在結腸癌病理進程中發揮重要作用。為此，本研究采用免疫組化法調查結腸癌患者SIRT6蛋白性質，分析SIRT6蛋白和結腸癌病理特征的關系，結果發現結腸癌TNM分期是影響SIRT6蛋白表達水平的獨立因素，提示隨著腫瘤分期的進展和浸潤深度的惡化，SIRT6蛋白表達被抑制，齊佳等［13］還認為SIRT6蛋白在結腸癌基因轉錄階段便出現缺失，提示SIRT6蛋白不僅參與結腸癌病理進程，其表達缺失還可能作為結腸癌變的標記物，但這有待進一步大樣本證實。另外，糖酵解能力增強是結腸癌患者典型的能量代謝特點［14］，SIRT6高表達能降低皮下脂肪和甘油三酯含量，糾正葡萄糖和胰島素水平，改善代謝障礙狀態。蒲詩云等［15］研究也認為SIRT6能促進氧化磷酸化，這對延緩腫瘤進展具有重要意義，與本文結論一致。

HIF-1α是細胞代謝過程中重要的調控因子，與HIF-1β形成復合物，參與相關信號通路的轉錄活化，A Prigione等［16］研究發現HIF-1α能上調己糖激酶2和丙酮酸脫氫酶激酶-I表達水平，參與結腸癌發生發展。本研究也顯示SIRT6與HIF-1α具有顯著負相關性，說明SIRT6可通過調節HIF-1α表達，參與結腸癌病理進展。另有報道顯示SIRT6能調節HIF-1α水平，進而啟動H3K9去乙酰化，下調其表達水平，抑制腫瘤細胞代謝途徑［17］，這可能是SIRT6發揮保護結腸癌進展的作用機制之一。但臨床也有報道顯示SIRT6可能具有促進腫瘤進展的作用，提示SIRT6可能具有異質性［18］，此外本研究樣本量小，研究結果有待大樣本證實。

綜上，結腸癌SIRT6表達水平與患者臨床病理分期具有顯著相關性，SIRT6高表達有助于抑制腫瘤進展，這可能與SIRT6蛋白調控HIF-1α水平有關。

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