微小RNA與弱精子癥發病機制的相關研究進展

王歡，江莉

精子發生是一個復雜的多因素調控過程，二倍體的精原細胞經過一系列生化、生理和形態學的改變，形成單倍體精子。染色體異常、基因調控異常，環境因素、感染因素、免疫因素、內分泌失調，以及其他疾病如精索靜脈曲張、輸精管阻塞、抗精子抗體、隱睪癥、逆行射精、睪丸癌、繼發睪丸創傷等，可導致精子發生障礙從而引起男性不育。其中，弱精子癥是最常見的男性不育癥類型，指精液中前向運動的精子數量（A類和B類）低于50%或快速直線前向運動的精子數量低于25%的病癥，主要特征表現為精子活力差，前向運動能力低。約70%的不育男性存在不同程度的弱精子癥［1］，至今對其發病機制尚未能確切闡明。目前普遍認為，基因調控異常是弱精子癥發病的中心環節。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）功能的研究正在不斷深入，其主要研究熱點包括細胞的增殖分化和凋亡、胚胎發育、癌癥發生和惡變、病毒感染等。在男性不育研究領域，研究者們一致認為，miRNA通過調控其特異的靶基因轉錄和翻譯而影響精子發生過程。在此，本文對miRNA在弱精子癥發病機制中參與調控作用的研究進行綜述。

1 睪丸組織中的miRNA

miRNA是單鏈、內源性的非編碼小分子RNA，長度為22～24個核苷酸。miRNA基因在細胞核內通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄產生初始轉錄本，即pri-miRNA，然后在Drosha RNase酶的作用下剪切為60～70 bp的miRNA前體（pre-miRNA），pre-miRNA通過核內的轉運蛋白Exportin-5轉運到細胞質中，再由Dicer進一步剪切成為成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與靶向mRNA的3'非編碼區（3'UTR）堿基互補配對，在轉錄后對基因的表達進行負向調控，從而引起靶向mRNA的降解或翻譯抑制［2］。miRNA主要是對內源性mRNA進行修飾，并且在表達上具有發育時序性和組織特異性，參與細胞的生長、增殖和凋亡等過程。

miRNA在哺乳動物的睪丸、附睪、精原細胞、精子和精漿中廣泛表達［3］。2013年，YANG等［4］首次用Solexa高通量測序技術檢測人類睪丸miRNA，發現770個已知的miRNA和5個新的miRNA。采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）對這些miRNA進行驗證，結果表明，檢測到的miRNA在人睪丸中均有表達，以let-7家族的表達最為明顯，其中let-7f-5p、let-7a-5p、let-7c、let-7b-5p、let-7g-5p的表達最為豐富。

miRNA在靈長類動物的成熟和未成熟睪丸組織存在差異表達。部分miRNA在靈長類動物未成熟睪丸組織中高度表達，而在成熟睪丸組織中不表達［5］，如hsa-miR-154；而有些miRNA在靈長類動物成熟睪丸組織中高表達，而在未成熟睪丸組織中不表達，如hsa-miR-34b、hsa-miR-34c、hsamiR-449、has-miR-124a、hsa-miR-449 等。

LUO等［3］通過高通量測序比較長白公豬精子發生的3個主要階段的miRNA表達譜，分別構建了睪丸、附睪和精子3個小RNA文庫，共獲得3 821個編碼4 761個成熟miRNA的前體發夾結構，其中有23個miRNA*。3個文庫中共同表達的miRNA有710個，而764個（16.05%）miRNA在睪丸特異表達，1 416個（29.74%）miRNA在附睪特異表達，784個（16.47%）miRNA在精子特異表達。檢測到的4 761個miRNA中，有1 447個是5'鏈miRNA，1 434個是3'鏈miRNA，其余1 880個（940對）miRNA是姐妹鏈，這些成對的姐妹鏈來自相同的前體，占總成熟序列miRNA的1/3，而且同對姐妹鏈之間相互獨立，具有各自的階段特異性表達。該研究證實了miRNA及其對應的miRNA*來自同一前體，這是miRNA在睪丸表達的特征。由此可見，miRNA在睪丸組織及其不同發育階段的表達存在特異性，說明miRNA對精子發生、發育有著不可或缺的作用。

2 miRNA與精子發生

與體細胞相比，miRNA在原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）、精原干細胞（spermatogonial stem cell，SSCs）和精原細胞中有更高的表達水平［6-7］。因此，miRNA被認為是生殖細胞發育的強有力調節器。哺乳動物的PGCs來源于胚胎外胚層，人類PGCs可能在原腸胚時期（約第17天的胚胎）形成。在4周時，原始生殖細胞位于鄰近卵黃囊壁靠尿囊處，通過后腸遷移到生殖嵴（胚胎性腺）［8］，并隨著性腺的不斷分化而迅速增殖。因而，PGCs是各型生殖細胞的祖細胞，是哺乳動物生命周期得以延續的關鍵第一步。目前明確在PGCs特異表達的有miR-290-295、miR-17-92基因簇和miR-302家族等，miR-302家族包括miR-302a-3p/-5p、miR-302d-3p、miR-302c-3p，其已驗證的靶基因是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）［7］。精子發生的持續進行依賴于小亞群未分化的具有干細胞功能的精原細胞，即SSCs。有研究發現，miR-20、miR-21、miR-34c、miR-135a、miR-146a、miR-182、miR-183、miR-221/222、miR-204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在 人SSCs特異表達，參與調控SSCs的自我更新和分化［9］。轉染miR-221/222抑制物后，小鼠未分化的SSCs池數量下降，引起與生殖細胞衰老相關的功能障礙，但不引起細胞凋亡［10］。HUSZAR等［11］研究miRNA介導的基因調控在維持精原細胞未分化狀態及其誘導分化的作用，發現miR-146在未分化的精原細胞中高表達，參與調控維甲酸誘導的小鼠精原細胞分化，其中一部分由Med1（維甲酸受體的輔調節因子）介導。miR-17-92基因簇是含有共同miRNA位點的4個不同miRNA家 族（miR-17、miR-18、miR-19、miR-25）， 可 能 參 與SSCs的早期分化，也在未分化的精原細胞中表達，在分化過程中表達下調。miR-17-92基因簇能下調E2F1基因，避免精子發生過程中減數分裂的細胞凋亡。DDX4 Cre誘導miR-17-92基因簇使生殖功能障礙，睪丸體積減小和質量減輕［12］。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠出現生殖功能障礙和異常的睪丸表型（如睪丸嚴重萎縮，精原細胞、SSCs丟失，生殖細胞凋亡和精子生成減少）［13］。

在精子發生的不同細胞階段，miRNA的表達也有所不同。從睪丸組織分離的細胞群，如支持細胞、精原細胞、粗線期精母細胞、圓形/長形精子細胞和精子，有28種睪丸特異miRNA共同表達，表明在精子發生過程中減數分裂后期和單倍體生殖細胞是miRNA產生的主要來源［14］。COMAZZETTO等［15］探討了miRNA通路在精子發生有絲分裂后期的作用，發現Dicer酶的表達在粗線期精母細胞達到最大值。越來越多關于Dicer酶與生殖細胞的研究也證實了miRNA對精子發生調控信號的重要性［16］。敲除Dicer的睪丸組織處于細胞增殖和/或分化的早期階段，延緩了精子發生過程，同時干擾miRNA的正常機制，長形精子細胞形態和活力發生異常［16-17］。

目前研究較多的是miR-34家族，該家族的miRNA有共同的種子序列GGCAGUG，在雄性生殖細胞特異表達，是生殖細胞進行減數分裂所必需。HILZ等［18］研究確定了miR-34b/c是哺乳動物精子發生所需的第1個miRNA位點。隨著減數分裂的開始，miR-34家族的表達也急劇增加。敲除miR-34家族基因的小鼠可導致不育，此外，這些小鼠很少能產生成熟的精子。miR-34b/c的缺失并沒有阻止精子發生本身，但干擾了正常發育階段之間的轉換，最終導致精子計數低、精子形態畸形和活力異常。miR-34c主要在減數分裂的后期形成，參與精子發生。miR-34c的靶基因TGIF2，其下調后促進TGFB信號轉導通路，而該通路參與了精子發生過程中粗線期精母細胞和圓形精子細胞的形成［19］。除了miR-34家族，miR-29家族是第2個發現的在精子發生過程也有重要作用的miRNA家族，且miR-29家族參與生殖細胞減數分裂前和減數分裂時的轉錄調控作用比miR-34家族介導得更為廣泛。miR-29家族可能在減數分裂過程中主要對雙鏈DNA斷裂進行修復，此外還能調節多種細胞外基質成分，對生殖細胞基底膜動力學發揮一定作用［20］。

精子發生過程中基因表達的轉錄后調控是極其活躍的，表明miRNA-mRNA調控網在精子發生翻譯水平中發揮了潛在作用。miRNA介導過渡蛋白（TPs）和魚精蛋白（PRM）翻譯水平的調控，而TPs和PRM表達的正確時機是晚期精子發生中組蛋白-PRM成功轉型的關鍵。TP2和PRM2 mRNA是睪丸特異miR-469的靶基因，miR-469抑制粗線期精母細胞和圓形精子細胞TP2和PRM2蛋白的表達，在翻譯水平對mRNA的降解有輕微影響［21］。PLCXD3蛋白在人和小鼠中呈組織特異性表達，在精子發生后期，miR-34c-3p能降低PLCXD3翻譯水平，導致睪丸功能障礙［22］。

3 miRNA與弱精子癥

越來越多的研究表明，正常的精子發生與生精障礙的miRNA具有不同的表達模式，這些差異表達的miRNA可為明確弱精子癥的發病機制提供依據，也可作為診斷弱精子癥新的生物標志物基礎。2013年ABU-HALIMA等［23］通過高通量miRNA微陣列平臺分別檢測弱精子癥、少弱精子癥患者和正常組精液，與正常組比較發現，弱精子癥組有50個miRNA表達上調，27個miRNA表達下調，其中miR-30a、miR-24、miR-1274a和miR-4286差異顯著；少弱精子癥組有42個miRNA表達上調，44個miRNA表達下調，其中miR-200c、miR-34b*、miR-15b、miR-34c-5p、miR-449a、miR-16 和miR-19a差異顯著。弱精子癥組和少弱精子癥組有34個miRNA共同表達，包括27個miRNA表達上調和7個miRNA表達下調，其中miR-141、miR-193b、miR-26a、miR-29a、miR-429、miR-200a、miR-99a、miR-363、miR-34b、miR-197和miR-122表達差異顯著。2016年ABU-HALIMA等［24］研究發現，與正常組精漿比較，少弱精子癥患者有36個miRNA表達顯著差異，其中7個miRNA表達上調，以miR-1275表達最顯著；29個miRNA表達下調，以miR-26b表達最顯著。

弱精子癥以新鮮精液中精子前向運動能力低和精子活力差為特點。正常情況下，精子活力是在附睪獲得的，是精子從陰道遷移到輸卵管、穿透卵丘、參與受精的重要動力。在維持人類精子活力的過程中，線粒體在提供能量方面起著舉足輕重的作用［25］。而miRNA介導的基因表達是調控線粒體功能的重要機制之一。線粒體相關的miRNA為線粒體功能潛在的調控因子，這些miRNA由核基因組和線粒體基因組編碼，可以調節核基因編碼的線粒體相關蛋白，也可以轉運到線粒體中，從而調控線粒體基因表達，參與多種疾病的發生。在男性不育方面，精漿中線粒體相關miRNA，即sp-miRNA（seminal plasma miRNA）在弱精子癥中起著重要作用。ZHOU等［26］通過匯集TLDA芯片檢測嚴重弱精子癥患者精液，發現136個sp-miRNA表達顯著改變，同時篩選出與線粒體功能密切相關的18個miRNA，通過實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（qTR-PCR）驗證發現，弱精子癥組精漿中miR-151a-5p明顯過表達，而miR-101-3p、let-7b-5p明顯低表達。轉染了miR-151a-5p模擬物的GC-2細胞，其基礎呼吸耗氧率、三磷腺苷（ATP）產生和質子滲漏均顯著下降，表明miR-151a-5p的過表達能誘導細胞線粒體功能障礙，降低線粒體電子傳遞鏈的活動，從而影響精子活力。

miRNA的調控作用貫穿到精子發生、發育和成熟的整個過程。這些過程需要一個精準的、具有空間性和時間性的基因調控表達模式。目前已經發現了一些參與精子活力的基因， 如 Tektin-t（Tektin-2）、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2 等。CRISP2是精子頂體和精子尾部外致密纖維的組成部分，其可以調節精子鞭毛運動，在頂體反應過程中從頂體釋放出來［27］。弱精子癥患者多有CRISP2低表達或miR-27b的過表達，出現精子活力低下和精子形態異常的趨勢［28］。miR-27b主要通過調控轉錄后水平抑制CRISP2蛋白表達，影響精子活力。而miR-27a在弱畸精癥患者中高度表達，主要通過抑制同一靶基因CRISP2影響精子形態，導致精子畸形［29］。

4 結論和展望

近年來，人們對miRNA在睪丸組織的廣泛表達及其在精子發生中參與基因表達的調控功能有了越來越多的認識。一些miRNA特異表達于睪丸組織，在其他組織中不存在，且其表達具有時序特異性和細胞特異性。一個miRNA可能有多個靶基因，或者一個基因受多個不同miRNA的調控。在體內外諸多因素的干擾下，一旦miRNA-mRNA這個復雜的調控網發生改變，就會阻礙精子發生的有序進行，從而導致男性不育。目前對miRNA參與生殖細胞增殖、分化和凋亡的調控作用的研究主要集中在精子發生的中晚期階段，而對精子發生早期階段的miRNA研究仍較少，尤其是從精母細胞到精原細胞的過程。弱精子癥作為男性不育最常見的疾病，闡明其發病機制和提供診治新策略是首要解決的問題。隨著研究的不斷展開，miRNA在弱精子癥的表達及其靶基因潛在調控作用的研究逐漸深入，miRNA可能有望成為診斷弱精子癥和研發新藥的新型生物標志物，對生殖醫學領域具有重要意義。

本文文獻檢索策略：

（1）檢索數據庫：PubMed、中國知網、萬方數據知識服務平臺；（2）檢索詞：microRNA、miRNA、asthenozoospermia、spermatogenesis、male infertility、弱精子癥、男性不育、精子發生、精原細胞、精原干細胞；（3）時間限制：2000年1月—2017年7月。

作者貢獻：王歡進行文章的構思與設計、可行性分析，進行文獻/資料收集、整理，撰寫論文；江莉進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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