MicroRNA-590-5p、microRNA-103、microRNA-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因在肺癌中的表達研究*

陳瑩，張若冰，楊凱云，譚慧，平妮娜，吳錫南，何越峰

（1.昆明醫科大學 公共衛生學院，云南 昆明 650500；2.昆明醫科大學第三附屬醫院胸心外科，云南 昆明 650118）

MicroRNA（miRNA）是非編碼小分子RNA，長度約為22 nt，其被證實參與細胞的發育、代謝，以及細胞的死亡、凋亡等多種生物活動。近10年來研究證明，miRNA介導腫瘤的發生、發展[1]。肺癌是發病率、致死率高的疾病，多項研究發現正常組織和癌組織中miRNAs表達存在差異，部分miRNAs與腫瘤的發生、發展相關。miRNAs對肺癌的進展有影響[2-3]。研究顯示miR-34c-5p和miR-103均可提高細胞的存活率，并促進細胞的增殖，miR-34c-5p屬于miR-34c家族的一員，在多種腫瘤中呈低表達，而Dicer蛋白屬于RNAseⅢ家族，與miRNA和siRNA的功能密切相關，是RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的重要組成部分，并且可以影響細胞分化[3-4]。BRMS-1可通過調節細胞間縫隙連接信號轉導及抑制癌基因的表達抑制癌轉移[2、5]。本文采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），檢測肺癌組織和癌旁組織中miR-590-5p、miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1的表達量及相互關系，分析其與組織類型、臨床指標的關系，探討其在肺癌發生、發展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2011年1月于昆明醫科大學附屬第三醫院住院患者的手術切除的肺癌組織及癌旁正常組織，癌旁正常組織離癌組織＞5cm，將選取的組織分為肺癌組織組和正常組織組，每組樣本47例。其中鱗癌15例、腺癌32例。患者均為漢族；年齡32～71歲，平均（54.91±9.62）歲；男性32例，女性15例；吸煙29例（62%）；飲酒22例（47%）；低分化18例，中分化28例，高分化1例。32例腺癌的免疫組織化學指標如下，GSTπ：5例陰性（-），15例弱陽性（+），9例陽性（++），3例強陽性（+++）；PgP：7例陰性（-），14例弱陽性（+），9例陽性（++），2例強陽性（+++）；TOPOⅡ：6例陰性弱陰性（-），20例弱陽性（+），6例陽性（++）；肺耐藥蛋白：2例陰性（-），14例弱陽性（+），13例陽性（++），3例強陽性（+++）；與多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）：4例 陰 性（-），13例弱陽性（+），15例陽性（++）；P53：9例陰性（-），15例弱陽性（+），7例陽性（++），1例強陽性（+++）；Ki67：5%～90%平均數為32.67%。本實驗均取得患者知情同意。

1.2 方法

癌旁正常組織取下后10min內放入預先裝有RNA later（美國Ambion公司）溶液的試管中，先4℃浸泡8 h，然后放入-80℃冰箱中長期保存。通過查閱病理切片記錄確認組織病理類型。

1.3 RNA的提取和定量

利用Trizol（美國Invitrogen公司）提取總RNA，NCode ? VILO ? miRNA cDNA Synthesis Kit和 EXPRESS SYBR? GreenER ? miRNA qRT-PCR Kit（美國Invitrogen公司，A11193-052）進行逆轉錄，以上按說明書步驟操作。引物序列如下，miR-590-5p：CAGGAGCTTATTCATAAAAGTGCAG；miR-34c-5p：AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC；miR-103：CAGCATTGTACAGGGCTATGA ；BRMS1：TGCAGCGGAGCCTCAAG與TCACATCCAGACAG AAGCCCT；Dicer：TGGGTCCTTTCTTTGGACTG 與CTGGTTTGCAGAGTTGACCA。miRNA下游引物為試劑盒提供，利用ABI7900HT（美國ABI公司）對5個RNA進行qRT-PCR，2-△△CT表示相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，數據經過對數轉化后為正態分布，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，相關分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基因的表達特征

兩 組miR-103、miR-34c-5p、Dicer及BRMS-1基因表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中肺癌組織組miR-103、Dicer較正常組織組低，表達下調；肺癌組織組BRMS-1、miR-34c-5p較正常組織組高，表達上調。見附表。

附表 兩組基因的表達特征 （n =47，±s）

組別 miR-590-5p miR-103 miR-34c-5p Dicer BRMS-1肺癌組織組 6.53±3.39 3.63±2.10 8.60±2.97 4.67±2.34 5.64±2.57正常組織組 5.77±3.53 7.49±1.75 6.90±3.28 6.76±2.73 2.37±2.33 t值 1.048 9.519 2.602 3.942 6.161 P值 0.149 0.000 0.005 0.000 0.000

2.2 肺癌組織RNA與免疫組織化學指標的相關性

miR-34c-5p與P53呈正相關（r=0.402，P=0.034），miR-103與多藥耐藥相關蛋白呈正相關（r=0.563，P=0.020），Dicer與P53呈負相關（r=-0.381，P=0.040）。

2.3 兩組miRNAs與mRNA的相關性

正常組織組中Dicer與miR-590-5p、miR-103及miR-34c-5p呈負相關（r=-0.382、-0.369和-0.403，P=0.041、0.034和0.023），而肺癌組織組中均未發現有相關性。

3 討論

隨著越來越多關于miRNAs的研究，發現miRNAs在生物代謝過程中和病理過程中起著重要作用[6-7]。miRNA可影響大多數目標基因表達，近幾年來大量的miRNA被定義為致癌基因或抑癌基因，比如miR-335、miR-206及miR-126在乳腺癌中視為癌轉移的標志，宮頸癌中miR-126、miR-143及miR-145和肺癌中的miR-451被視為致癌基因[7-9]。miRNA成熟過程通常是由基因組轉錄出初始轉錄pri-miRNA，再由Dicer等組成的復合物切割形成成熟miRNA并加入RISC復合物，行使其生物學功能[10-11]。miR-590-5p在宮頸癌、肝癌組織中表達下調[10]，而本次研究發現肺癌組織中的miR-590-5p表達與癌旁正常組織比較無差異。miR-103在結腸直腸癌中為致癌基因[11-12]，而本研究證實miR-103在肺癌組織中表達下調。miR-34c-5p基因的研究甚少，本研究發現肺癌組織與癌旁正常組織中miR-34c-5p表達量有差異，在肺癌組織中表達上調。有研究顯示Dicer在乳腺癌、口腔鱗狀上皮細胞癌以及其他不同癌組織中表達異常[13-16]。本研究中Dicer在肺癌組織中表達下調。BRMS-1被證實在乳腺癌、黑色素癌、卵巢癌及鼻咽癌中表達下調，且可能與癌細胞的入侵、轉移和患者的預后有關[17-18]。而在肺癌組織中BRMS-1表達上調，其原因需進一步研究。

本文肺癌組織中RNA與免疫組織化學指標的關系相關性研究發現，miR-34c-5p和P53呈正相關；miR-103和MRP呈正相關，Dicer與P53呈負相關。肺癌組織和正常組織miRNAs與mRNA的相關性研究發現，正常組織中Dicer與miR-590-5p、miR-103和miR-34c-5p均呈負相關，而肺癌組織中未發現有相關性。本研究提示癌組織與正常組織的4種基因表達量有差異，miR-103和Dicer在肺癌組織中表達下調，miR-34c-5p及BRMS-1表達上調。Dicer在前體基因轉錄為成熟基因過程中起到重要作用，推測肺癌組織中Dicer表達下調的原因，miR-34c-5p抑制Dicer基因的表達，可能由于miR-34c-5p結合在Dicer的位點上，使Dicer基因降解，而降低基因表達。

肺癌被視為威脅人類健康最常見的腫瘤之一，缺乏早期診斷方法，使其在世界范圍內是病死率最高的腫瘤[19]。本研究得到了miRNAs、mRNA與肺癌之間關系的流行病數據，但研究中對Dicer僅限于關聯研究，可進一步進行機制方面的深入探索。本次研究的意義在于通過對mRNA與miRNAs關系的探究，明確肺癌組織miRNAs表達異常與mRNA轉運異常表達有關，對闡明miRNAs轉錄調控和miRNAs表達調控機制有重要的意義，接下來應從機制研究入手，深度研究Dicer對miR-34c-5p及miR-103基因的影響及其機制。

參 考 文 獻：

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