轉基因及基因編輯技術與豬遺傳育種

李嘉楠，顧 浩，徐在言，左 波

（華中農業大學動科動醫學院，農業農村部豬遺傳育種重點實驗室，農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

1 轉基因與基因編輯技術概述

轉基因動物技術是指使用顯微注射或精子介導等相關分子生物學方法將外源基因導入到動物的早期胚胎細胞中，使外源基因能夠在受體細胞的基因組中穩定表達，并培育出可遺傳的動物個體或品系。與傳統的育種技術相比，轉基因技術不僅克服了物種間固有的生殖隔離，而且實現了物種間遺傳物質的交換。然而在動物育種中，許多優良性狀的產生并不需要依賴外源基因的導入，僅僅改變自身基因的表達就能獲得，這種方式被稱為基因編輯技術。新型動物基因編輯技術是指通過人工核酸酶對動物特定的內源性基因進行目地性的修飾，如敲除、敲入、定點突變等，并結合體細胞核移植與胚胎移植等技術手段，獲得被修飾編碼的個體。在基因編輯中，人工核酸酶作為操作基因的“剪刀”，可精確定位到需要編輯的DNA雙鏈，造成目的基因DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand-breaks，DSBs）；同時，DNA的（非）同源重組修復可作為“縫針”對斷裂的DNA雙鏈進行修復，實現基因的敲除和敲入。而隨著人工核酸酶技術的不斷發展，基因編輯技術共經歷了三代，即鋅指核酸 內 切 酶（zinc finger endonucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸 內 切 酶（transcription activatorlike effector endonucleases，TALENs）和 CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats /Cas（CRISPR associated 9）]技術。

鋅指核酸內切酶是第一代人工核酸內切酶，它是由鋅指蛋白和核酸酶FokⅠ組成可以結合DNA的嵌合蛋白。研究者按照1個鋅指可以識別3個堿基的識別規律來設計相應的鋅指蛋白，對DNA序列進行特異性識別。自2002年，首次在果蠅中應用成功后，Whyte等用ZFNs技術和體細胞核移植技術結合生產出eGFP轉基因豬，證明了ZFNs技術可以對體細胞核移植的供體細胞進行修飾。第二代人工核酸內切酶——類轉錄激活因子效應物核酸酶TALENs，其蛋白結構大小和鋅指蛋白一樣，除了TALENs的DNA結構域僅識別一種堿基之外，其他的作用機制與ZFNs完全一致，這就大大加快了組裝識別任何靶基因的TALENs。

CRISPR/Cas9系統作為第三代基因編輯工具，是由Ishino等于1987年在K12大腸桿菌中發現，是廣泛存在于細菌和古細菌體內的一種獲得性免疫系統[6]。改造后的Cas9系統主要由向導RNA和Cas9蛋白組成，向導RNA由一段20 bp大小的識別序列和一段可形成發卡結構的重復序列組成。識別序列通過堿基互補，靶向到基因組相應的位置，重復序列與Cas蛋白形成復合體并發揮酶切作用，切斷目標區域的雙核苷酸鏈。2013年，Feng Zhang等首次利用這一原理應用到真核細胞中，正式將其開發為基因組編輯新技術[7]。與前兩代人工核酸酶系統相比，CRISPR/Cas9系統簡潔高效，稱得上是21世紀重要的生物技術突破，為基因編輯技術提供了一個新的平臺。自從2013年第1頭使用CRISPR/Cas9基因敲除豬誕生后，目前利用CRISPR/Cas9技術進行功能基因篩選、抗病育種等研究在豬遺傳育種的應用上均已實現。

2 基因編輯技術在豬遺傳育種中的應用

2.1 提高豬只抗病能力

豬繁殖與呼吸綜合征（也稱豬藍耳病，PRRS）是一種由PRRS病毒引起的繁殖障礙和呼吸系統的傳染病，可導致母豬妊娠后期流產，仔豬呼吸系統疾病和大量死亡。同時由于豬藍耳病病毒的極高突變率和致病性，用疫苗難以進行防治，嚴重影響著養豬業。研究表明清道夫受體CD163是豬藍耳病病毒入侵細胞時的重要識別蛋白。2017年，Chrisine Burkard等 的研究團隊使用CRISPR/Cas9技術敲除豬CD163基因之后，進行侵毒試驗，結果表明轉基因敲除豬對PRRSV具有顯著抗病性。豬圓環病毒病是由圓環病 毒 2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）引起的多種疾病，可導致母豬繁殖障礙和斷乳仔豬多系統衰竭綜合征等，嚴重影響著我國養豬業的發展。研究發現該病毒是通過上調豬體內p53基因的表達來實現感染宿主細胞，導致宿主細胞的死亡。Xu等利用CRISPR/Cas9技術建立了P53基因敲除的PK15細胞系，來研究PCV2感染后p53基因所發揮的調控作用，為獲得抗豬圓環病毒病奠定了基礎。目前，利用基因編輯技術獲得的抗豬瘟病毒轉基因豬和抗小豬腹瀉轉人溶菌酶基因豬等抗病豬的產生，為我們防治豬病提供了另一條途徑。通過改變以往的藥物防治，從遺傳本質上提高豬對疾病病原的免疫力，減少抗生素的使用，做到防重于治、養重于防，對養豬業的發展以及人類健康都具有深遠意義。

2.2 提高生產性能

我國作為養豬大國，養豬不僅能夠為農業經濟帶來迅猛發展，而且豬肉作為人類生活肉類食品的重要來源，優質豬新品種的培育成為研究者的重中之重。1985年，Hammer 等的研究團隊將人的生長激素注射進豬的受精卵中，獲得的轉基因豬與非轉基因豬相比，生長速率、飼料轉化率都有明顯提高。隨后中國農業大學與湖北省農業科學院生物技術研究所合作，將豬的生長激素基因（growth hormone，GH） 轉 入 湖北白豬獲得的轉基因豬，其生物轉化率比同窩提高10%左右。肌肉生長抑制素myostatin（MSTN）是繼生長激素（GH）和胰島素樣生長因子（IGF）的又一新功能基因，對肌肉生長起負調控作用，控制豬個體生長發育和脂肪沉積，是改善豬生長性能的有效基因。2016年Bi等用CRISPR/Cas9技術得到了MSTN基因單敲除豬，使肌源性基因表達量上升，肌纖維數目的顯著增加表現出特定的“雙肌臀”現象。MSTN主動免疫還可以抑制肌酸激酶的活性，控制蛋白表達，提高個體瘦肉率。還有研究進一步發現 MSTN 對脂肪發育的抑制作用可下調PPARγ抑制脂肪形成。由MSTN誘導的脂肪細胞有提高胰島素和葡萄糖的敏感性及氧化能力等特點。因此，MSTN在畜牧生產過程中具有很好的研究意義和經濟價值。

2.3 改善豬肉質量

不飽和脂肪酸是人體所需的必需脂肪酸，對人體有很大的好處，可以改善心血管、降低老年癡呆和抑郁癥等。而豬肉中卻含有大量的飽和脂肪酸，食用大量的豬肉會使人產生高血壓、高膽固醇等疾病，增加冠心病的風險。2004年，K．Saeki等人將菠菜根部的FDZA基因轉入豬的基因組中，獲得了高不飽和脂肪酸轉基因豬。2006年，Lai等研究證明秀麗線蟲的FAT-1基因可以使豬肉中ω-6脂肪酸轉變為ω-3脂肪酸，通過體細胞克隆技術把該基因導入豬的基因組，培育出了富含ω-3脂肪酸的轉基因豬。隨后，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所和軍事醫學科學院生物工程研究所合作也獲得了轉ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉基因豬，大大提高了豬肉的營養價值。過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha， PGC1α），可誘導線粒體的生物合成和細胞呼吸功能，調控肌纖維類型轉化，改善豬肉品質性狀，2017年，華中農業大學通過轉基因豬模型超表達PGC1α基因，證實了肌纖維類型的轉變，由酵解型肌纖維轉化為氧化型肌纖維，為后續的肉質改良工作打下基礎。

2.4 降低環境污染

近年來，伴隨著農業經濟的發展，養殖業規?；⒓s化程度的不斷提高，養殖場排出的糞便也日益增加，其環境污染問題也日益突出。由于養殖戶環保意識不強、糞便處理能力差，導致養殖場的排泄物是繼工業三廢后的又一大污染源。植酸即肌醇六磷酸，作為磷酸的儲存庫，通常存在于植物中。飼料中富含的植酸未能被豬完全利用，不僅降低了氮磷利用率，也是糞便中氮、磷排放的主要來源。植酸酶（phytase）能有效分解植酸，催化肌醇六磷酸脫掉磷酸基團，早在19世紀初就引起了人們的注意。2001年，加拿大研究人員通過將大腸桿菌的phytase基因轉移到豬上，培育出可在唾液中分泌植酸酶的轉基因豬，不僅提高了豬對飼料中磷的利用率，也使豬糞中的磷含量出現顯著下降，且相對照于在飼料中添加植酸酶的豬其磷排放量也出現明顯降低。隨后，轉葡聚糖酶、轉木聚糖酶及轉真菌纖維素酶等轉基因豬的相繼出現，使得豬對于飼料中蛋白、纖維素、有機磷等營養物質的利用率顯著提高，進而顯著減少磷、氮排放。最近，華南農業大學吳珍芳團隊利用轉基因技術和體細胞克隆技術將4種微生物的酶類基因轉入豬的基因組中，獲得了無污染、高品質、快生長轉基因克隆豬。這4種酶類微生物只在豬的唾液腺中特異性分泌，伴隨飼料進入消化道，持續降解飼料中的有機磷，顯著提高了氮、磷、鈣等營養物質的吸收，同時與普通豬相比，糞便中氮、磷的排放下降了20%。

2.5 異體器官移植

人的器官移植供體資源短缺，最好的解決辦法就是異體器官移植。目前，豬在器官大小、生理、組織解剖上與人類相似，被認為是最佳異體器官移植的首選動物。異體器官移植的障礙往往在于細胞間的免疫排斥和豬內源性逆轉錄病毒。1995年，Cozzi等將人的補體抑制因子和衰退加速因子共轉到豬的胚胎中，獲得的轉基因豬在器官移植中未出現超敏排斥反應。2001年，研究人員通過對豬器官的細胞免疫抗原因子α-1，3半乳糖酶進行敲除，將獲得的轉基因豬器官移植給非人靈長類動物，數月后同樣未出現免疫排斥現象。2005年，Miyagawa等使用RNAi技術來抑制豬內源逆轉錄病毒的表達，結果顯示，RNAi可以抑制豬逆轉錄病毒在內皮細胞的表達，為生產抗豬逆轉錄病毒的轉基因豬提供了一個新方法。2015年，美國印第安納醫學院等培育了唾液酸糖蛋白受體基因敲除豬，減少在器官移植過程中血小板減少癥的發生。人血栓調節蛋白（hTM）可以在血管內皮細胞特異性表達，具有抗凝作用，清除體內凝血酶，目前，已經有研究團隊成功獲得可特異性表達hTM轉基因細胞系及轉基因克隆豬，為解決異體器官移植后凝血紊亂提供理論資料。

2.6 動物疾病模型

合適的動物模型可以推動醫療技術的發展，和嚙齒類的大、小鼠等相比，豬、羊等大動物與人類在基因組上有較高的同源性，且在體型、生理代謝、疾病特征上的優勢更適合用作動物模型、人類疾病和生物制藥等研究。2010年，Yang等使用亨廷頓蛋白轉基因載體，成功獲得6頭亨廷頓舞蹈癥轉基因豬，該成果對于亨廷頓舞蹈癥病理發生機制的研究奠定了基礎。Lp-PLA2基因可調節動脈粥樣硬化，2013年，紀元等獲得了Lp-PLA2基因的豬成纖維細胞系，為開發治療動脈粥樣硬化藥物提供新的模型和突破。2015年，北京蛋白質組研究中心使用CRISPR/Cas9技術在豬白蛋白基因區域插入了人類白蛋白基因，讓豬只產生人血白蛋白，而不產生豬白蛋白。2016年，中國科學院使用單堿基基因編輯技術，僅僅只改變一個堿基，便獲得了只分泌人胰島素的克隆豬，提取的胰島素完全為人胰島素，而不含豬胰島素。因此，使用新型基因編輯技術尋找疾病早期分子標志、闡明相關疾病發病機理、研究新的治療方法、和開發新藥具有重要意義。

3 展望

隨著基因編輯技術的不斷發展，不斷成熟，基因編輯和轉基因動物的生產及相關產品已顯示出了廣闊的應用前景和重大的經濟價值。基因編輯的工具越來越精細化，不僅可對基因進行大片段的刪除或轉入，也能實現定點單個堿基的改變，基因定點編輯技術已逐步成為轉基因技術研究的核心。盡管對基因的可操縱性越來越強，但是要形成穩定安全的新品種（系），并進入產業化、市場化，還需要與傳統育種技術結合，并開展轉基因動物的安全評價以及消費者的認可，目前已有多個轉基因豬新材料正在進行農業部安全評價，如MSTN基因敲除豬、轉ω-3脂肪酸去飽和酶基因豬等，相信這些育種新材料將會給我國養豬業帶來新的發展機遇。

（參考文獻略）