微流控技術在腫瘤血管生成中的應用進展

馬曉潔，陳巧云，余曦冉

（1.川北醫學院附屬醫院 腫瘤科，四川 南充 637000；2.川北醫學院2013級臨床醫學系，四川 南充 637000）

微流控芯片是一種新型的技術平臺，它利用不同的芯片材料構造出微米級的通道結構，結合微流體控制技術，能夠相對精確地再現腫瘤微環境，并能動態地觀察血管生成過程中腫瘤微環境所發生的變化。以其獨特的優勢，有逐漸取代傳統的腫瘤血管生成體外模型的趨勢。本文就微流控在腫瘤血管生成中的應用做一綜述。

1 微流控技術

微流控技術是研究如何在微米和亞微米尺度下控制微小流體和顆粒的科學，以分子分析、生化防御、分子生物學和微機電系統技術為基礎發展起來的1個新興學科，已在醫學方面得到廣泛的研究和應用。微流控芯片（microflu-idics）是微流控技術的具體實現形式，是目前微全分析系統（micro total analysis system，u-TAS）中發展最為迅速和熱門的領域。

不同的微流控芯片可以發揮不同的作用，集成聚碳酸酯多孔膜的雙層通道微芯片裝置可以模擬細胞的相互作用，而具有多層微通道結構的微流控芯片，能篩選出最利于細胞生長的芯片通道條件[1]。微流控技術具有非接觸、精確度高、組織培養、營養供應和廢物清除功能等[2]優點，而且其與傳統的流體系統相比，具有許多優勢尤其是其強大的集成能力，可使實驗中的反應、前處理及檢測等流程都能集成到1個微流控系統中完成。所以該項技術已在醫學、生命科學等眾多科學領域展示前所未有的發展潛力和應用價值。

2 腫瘤血管生成模型

腫瘤血管生成是指已存在的毛細血管網通過“萌芽”或“分叉”等方式生長出新的毛細血管的過程，其具體形成方式包括了出芽式血管生成[3]、血管生成擬態[4]、馬賽克血管[5]、血管共選擇[6]、募集內皮祖細胞[7]和淋巴管生成等[8]。

目前傳統的腫瘤血管生成體外模型包括：①內皮細胞增殖實驗模型：是在腫瘤血管生成中內皮細胞大多呈過表達狀態為依據。檢測細胞增殖常用方法：MTT法、SRB法、[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法[9]。其缺點分別為：MTT法的實驗結果受到細胞數量、MTT濃度、殘留培養液的影響；SRB法只適用于貼壁細胞，而且操作過程繁瑣，易造成人為誤差；[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法不僅要使用具有安全風險的放射性物質，而且需要通過細胞凋亡實驗藥物來評估藥物對細胞增殖的影響，以排除藥物毒性作用因素；②細胞遷移實驗模型：包括創傷愈合模型和Boyden小室模型。這2種模型存在的缺點：創傷愈合模型，操作簡便，但忽視劃傷單層細胞后傷痕愈合過程中細胞增殖對實驗結果的影響[10]。Boyden小室模型，操作技術要求高且人為因素影響較大，而計數方法不同也會造成統計結果誤差較大[9]；③管腔形成模型：主要是考察內皮細胞在基質表面形成毛細血管網的能力[11]，該法不能實現對血管形成過程的實時動態的監測；④大鼠動脈環模型：是將包埋于纖維蛋白膠或膠原蛋白膠的大鼠動脈環在培養液中培養，觀察血管出芽情況的方法[12]。但其缺乏正常的血液循環系統，使所處的血管環境脫離腫瘤微環境而導致其新生的血管的特性上與腫瘤微血管有差異。

腫瘤血管形成是1個非常復雜的過程，受多種因子的影響[13]。目前，傳統的實驗方法除其自身的缺點外，大多只是通過單因素、二維、甚至靜態的方式進行研究，未能實現在3D條件下對血管生成過程進行動態的、多因子間的研究。而且傳統的體外腫瘤血管生成模型僅僅針對腫瘤和血管的培養，而忽視對腫瘤微環境對血管生成的影響，缺乏腫瘤微環境的內皮細胞容易出現分子特征的變化，使得最終獲得的實驗結果與實際存在巨大的差距。為克服上述缺點，構建出更接近理想的腫瘤血管生成模型的體外模型成為一項艱巨的任務。

3 微流控在腫瘤血管生成中的應用

近年來，微流控芯片技術發展迅速，在生命科學尤其是細胞研究領域得到廣泛應用。微流控技術不光可以模擬腫瘤細胞生長微環境，為腫瘤微環境下的相關問題研究提供1個簡便的研究平臺，還可以給細胞提供一個立體的生長環境，實現對腫瘤微環境中細胞轉移的各種關鍵參數進行動態調節[14]，實時動態觀察細胞如何適應腫瘤微環境的變化[15]，并可以實現在可溶性生化因子的濃度梯度分布下腫瘤血管細胞生長的研究[16]。

3.1 微流控技術可以輕松解決對培養環境中流體壓力的精確控制的難題

在腫瘤微環境內高滲性腫瘤血管提高間質流體壓力并改變流動模式，該異常流體壓力可以通過刺激腫瘤細胞和內皮細胞進而促進腫瘤血管生成推動腫瘤生長進程。BUCHANAN等[17]設計的一種體外腫瘤細胞與內皮細胞共培養的微流控系統，以探究不同流動剪切應力對腫瘤血管生成的影響，通過定量轉錄聚合酶鏈反應的分析下游分子，發現在管腔低流量條件下與內皮細胞共培養的腫瘤細胞增加促血管生成基因的表達。這凸顯出微流控技術在評估內皮和腫瘤細胞對不同流動剪切應力條件下腫瘤血管生成反應的優勢。

3.2 微流控技術可以再現腫瘤微環境

由腫瘤細胞、成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞和細胞外基質及其分泌的生長因子參與組成的腫瘤生長局部穩態環境，稱為腫瘤微環境。目前研究發現，腫瘤血管的生成與微環境中各因素的變化著密切的關系[18]。微流控技術可模擬腫瘤微環境，研究其對腫瘤血管生成的影響。STROOCK等[19]構建一微流控平臺，能夠很好地實現對腫瘤微環境的再現，包括大部分由腫瘤細胞組成的混合細胞群及其周圍的間質細胞和由內皮細胞內襯的血管，并通過仿生灌注免疫細胞來模擬其被運輸和招募的過程。這實現對腫瘤微環境的近似模擬，使得構建出的模型更接近體內腫瘤微環境。

傳統體外模型往往因其無法控制生化梯度和獲取單細胞水平的圖像而停滯不前。微流控技術下的體外模型可很好彌補這點缺憾。CHUNG等[20]制作一種新型微流控平臺，在這個平臺上通過訪問圖像來實現對生化和生物力學因素的采集，可以清楚地觀察到Mtln3癌細胞系吸引的內皮細胞和誘導血管生成的過程，與此同時還能實現對內皮細胞與癌細胞共培養環境中的機械、生化因素的精確控制，來完成對腫瘤血管生成的影響因素進一步探討。LEE等[21]提出有關于轉移腫瘤產生微血管的微流控芯片，與其他模型相比其優點在于腫瘤血管生成過程中癌組織與血管接口可實現精確成像，并對血管生成反應和腫瘤細胞的跨內皮遷移的定量分析。

3.3 微流控技術能實現對腫瘤血管的特性的模擬還原

腫瘤血管不同于正常組織血管，其特性表現為：①血管結構扭曲多變，管徑大小不一；②血管壁薄而具有高度通透性；③血管血流紊亂，常靜止不流動或倒流[22]。該腫瘤血管的特性在傳統的體外血管生成模型常未被考慮，而微流控卻能憑借自身優勢實現對腫瘤血管的特性進行模擬還原。對此翟萬銀等[23]運用微加工技術，構建腫瘤血管微流控芯片。該芯片不僅能夠控制微管道內液體的流動方向和速度，實現腫瘤血管內血液流向、流速的多變特點的模擬，并能節段性地調整微縫段管道的流向和流速模擬扭曲和粗細變化不均的腫瘤血管結構，還能通過促進內皮細胞遷移而使得血管出現穩定的泄漏點，實現對腫瘤血管高通透性的特點進行再現，這使得構建出的腫瘤血管更接近真實情況。

3.4 微流控技術可重建體內血管出芽形成過程

出芽式血管生成是腫瘤血管生成的主要方式。傳統體外模型不能模擬出從內皮細胞到尖端細胞及柄細胞演變的動態過程，而微流控技術在細胞的定性、定量研究和增強成像以及內部生物控制能力上的優勢，能夠再現該過程。

NGUYEN等[24]構建一種三維出芽式血管生成的微流控模型，實時動態地觀察到與體內出芽式血管生成標志結構一致的特征，由此表明該三維微流控模型能夠很好重建體內血管出芽形成過程，有助于人們對該過程中所受影響因素展開研究。VERBRIDGE等[25]制作一種微流控模型，通過該仿生模型可觀察在血管內皮生長因子的空間梯度變化下內皮細胞涂層血管的出芽情況，并能夠實現微流控平臺上生物和物理參數的調節。JEONG等[26]構建一微流控平臺，通過其不僅能夠精確控制內皮細胞的化學刺激，而且具備優良的光學分辨率和原位監測在化學梯度變化下的細胞形態的改變，這使得出芽式血管生成的整個動態演變過程能得到真實的反應。

3.5 微流控在腫瘤血管生成應用中存在的缺陷

微流控技術成功地用用宏觀尺度的方法來真實地模擬血管的生成、入侵及外滲，并取得可喜的成果。但即使是目前最先進的三維微血管灌注式模型仍然不不具備趨化因子梯度定向誘導癌細胞趨化遷移的能力，且新生血管網的幾何結構也難以預測[27]。有研究者試圖克服該問題，HYUNJAE等[28]人建立1個模型，能實現清楚地成像和定量血管生成反應，具備介導癌細胞進入與微血管壁相鄰的不同位置的能力，即腫瘤細胞跨內皮轉移，同時模型能產生和維持生長因子和引誘劑的空間濃度梯度。然而，該模型仍然有缺陷，即血管出芽起源于沒有細胞-細胞連接的內皮細胞簇，而不是先前存在的血管，這與體內病理狀態下，腫瘤血管生成出芽起源于癌群附近完全血管有所差異。

所以綜合起來微流控腫瘤-血管生成模型仍然存在一系列亟待解決的問題：①從微流控獲得的結果與臨床腫瘤組織間情況的關聯性問題[29]；②對體內腫瘤微環境的還原度問題；③模型的穩定性和可重復性問題。針對該缺點，都需要進一步深入探索研究來使模型更加完善。

4 結論與展望

現今腫瘤血管生成體外模型的不斷地被人們應用于腫瘤血管的研究，隨著人們對腫瘤血管的認識逐漸深入，多種的血管生成方式為人們所熟知。這也為腫瘤血管體外模型的構建提供更多的方向，而微流控技術憑借其各項優勢為腫瘤血管生成體外模型的研究提供很好的研究前景，雖然目前還有一些需要大家繼續探索解決的問題，但是整體上該技術的先進性有效性是毋庸置疑的，期待該技術在不久的將來大放異彩。

[1]MONGERSUN A, SMEENK I, PRATX G, et al. Droplet microfluidic platform for the determination of single-cell lactate release[J]. Anal. Chem, 2016, 88(6), 3257-3263.

[2]OZCELIKKALE A, MOON H R, LINNES M, et al. In vitro microfluidic models of tumor microenvironment to screen transport of drugs and nanoparticles[J]. WIREs Nanomed.Nanobiotechnol,2017, 9(5): e1460.

[3]WEI Z, WANG S, SHENG X, et al. Molecular regulation mechanism of tumor sprouting angiogenesis[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2013, 29(9): 1196-1204.

[4]MANIOTIS A J, FOLBERG R, HESS A, et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry[J]. Am J Pathol, 1999, 155(3): 739-752.

[5]CHANG Y S, DE TOMASO E, MC DONALD D M, et al. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact withinflammatoryowing blood[J]. Proc Natc Acad Sci USA, 2000, 97(26): 14608-14613.

[6]WESSELING P, RUITER D J, BURGER P C, et al. Quantitative immunohisto-logical analysis of the microvasculature in untreated hman glioblas-toma multiforme. Computer-assisted image analysis of whole-tumor sections[J]. Journal of Neurosurgery, 1994, 81(6):902-909.

[7]LIU R, WANG H. endothelial progenitor cells and neovascularization of tumors[J]. International Journal of Pathology and Clinical Medicine, 2006, 26(4): 325-328.

[8]WITTE M H, BERNAS M J, MARTIN C P, et al.Lymphangiogenesis and lymphangiodysp lasia: from molecular to clinical lymphology[J]. Microsc Res Tech, 2001, 55(2): 122-145.

[9]XING Y, LIU G, CHEN H. Models of tumor angiogenesis assay[J].Letters in Biotechnology, 2012, 23(3): 444-447.

[10]LAMALICE L, LE BOEUF F, HUOT J. Endothelial cell migration during angiogenesis[J]. Circ Res, 2007, 100(6): 782-794.

[11]XIE Z. A microfluidic-based model for investigation of tumorinduced angiogenesis[D]. Dalian: Dalian Medical University,2013: 1-46.

[12]ZHAO J, MIAO J, et al. Establishment of an in vitro model of tumor angiogenesis in vitro[J]. China Biotechnology, 2006, 26(3):17-21.

[13]NYBERG P, SALO T, KALLURI R, et al. Tumor microenvironment and angiogenesis[J]. Front Biosci, 2008, 1(13):6537-6553.

[14]STOCK K, et al. Capturing tumor complexity in vitro: comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery[J]. Sci Rep, 2016(6): 28951.

[15]AIJIAN A P, GARRELL R L. Digital microinflammatoryuidics for automated hanging drop cell spheroid culture[J]. J. Lab Autom, 2015(20):283-295.

[16]PFISTERER L, KORFF T. Spheroid-based in vitro angiogenesis model[J]. Methods Mol, Biol, 2016(1430): 167-177.

[17]BUCHANAN C F, VOIGT E E, SZOT C S, et al. Threedimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2014, 20(1): 64-75.

[18]CHOI Y, et al. A microengineered pathophysiological model of early-stage breast cancer[J]. Lab. Chip, 2015(15): 3350-3357.

[19]STROOCK A D, FISCHBACH C. Microfluidic culture models of tumor angiogenesis[J]. Tissue Eng Part A, 2010, 16(7): 2143-2146.

[20]CHUNG S, SUDO R, MACK P J, et at. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microinflammatoryuidic platform[J].Lab Chip, 2009, 9(2): 269-275.

[21]LEE H, PARK W, RYU H, et al. A microfluidic platform for quantitative analysis of cancer angiogenesis and intravasation[J].Biomicroinflammatoryuidics, 2014, 8(5): 054102.

[22]YANG J, CHEN Z. Advances in the study of angiogenesis and tumor growth[J]. Journal of Zhejiang University, 2001, 30(4):190-192.

[23]ZHAI W, WU L, JIA C, et al. A tumor capillary model preparation based on microinflammatoryuidic chip for permeability assay[J]. Journal of Functional Materials and Devices, 2011, 17(5): 505-512.

[24]NGUYEN D H, STAPLETON S C, YANG M T, et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(17): 6712-6717.

[25]VERBRIDGE S S, CHAKRABARTI A, DELNERO P, et al.Physicochemical regulation of endothelial sprouting in a 3D microinflammatoryuidic angiogenesis model[J]. J Biomed Mater Res A, 2013,101(10): 2948-2956.

[26]JEONG G S, HAN S, SHIN Y, et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform[J]. Anal Chem, 2011,83(22): 8454-8459.

[27]KIM S 1, LEE H, CHUNG M, et al. Engineering of functional,perfusable 3D microvascular networks on a chip, 2013, 13(8):1489-500.

[28]HYUNJAE L,WOOHYUN P, HYUNRYUL R, et al. A microfluidic platform for quantitative analysis of cancer angiogenesis and intravasation[J]. Biomicrofluidics, 2014, 8(5):054102.

[29]HSIEH-FU T, ALEN T, AMY Q, et al. Tumour-on-a-chip:microfluidic models of tumour morphology, growth and microenvironment[J]. J R Soc Interface, 2017, 14(131): 20170137.