卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX和PTEN的表達及臨床意義

吳鈴+葉健文+林舟

[摘要] 目的 研究抑癌基因WWOX及PTEN對卵巢漿液性腺癌細胞生長的影響，探討卵巢癌基因治療的新靶點。 方法 于2013年10月—2016年10月福州市第一醫院方便選取的60例卵巢漿液性腺癌標本作為研究對象，另選取30例正常卵巢組織作為對照。采用免疫組化檢測抑癌基因WWOX及PTEN的陽性率表達，RT-PCR法測WWOX及PTEN的mRNA相對表達量。 結果 卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的免疫組化陽性率及mRNA相對表達量均顯著低于正常卵巢組織組（P<0.05）。 結論 WWOX及PTEN基因缺失可能是卵巢漿液性腺癌發生的重要分子基礎，可能會干擾卵巢癌細胞的細胞周期并抑制其生長增殖，臨床研究有待從基因分子調控等方面進一步深入探討，為卵巢漿液性腺癌的基因治療提供一種新方法。

[關鍵詞] 漿液性腺癌；抑癌基因；WWOX；PTEN

[中圖分類號] R725 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）11（c）-0023-03

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of WWOX and PTEN on the growth of ovarian serous adenocarcinoma cells and to explore the new target of ovarian cancer gene therapy. Methods From October 2013 to October 2016， 60 cases of ovarian serous sex adenocarcinoma were selected from fuzhou first hospital，30 other normal ovarian tissue were selected as the control.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR.Immunohistochemistry was used to detect the expression of WWOX and PTEN， the mRNA expression of WWOX and PTEN was measured by RT-PCR. Results The immunohistochemical positive rate of mRNA and mRNA expression of WWOX and PTEN in ovarian serous adenocarcinoma were significantly lower than those in normal ovarian tissue （P<0.05）. Conclusion WWOX and PTEN may interfere with the cell cycle of ovarian cancer cells and inhibit their growth and proliferation， which may provide a new method for gene therapy of ovarian serous adenocarcinoma. WWOX and PTEN gene deletion may be an important molecular basis for the development of ovarian serous adenocarcinoma. Clinical research needs to be further explored in terms of gene molecular regulation.

[Key words] Serous adenocarcinoma； Tumor suppressor gene； WWOX； PTEN

卵巢漿液性腺癌發病率居我國婦科惡性腫瘤前列，是卵巢上皮性癌中最常見的組織學類型。目前卵巢漿液性腺癌有逐年增高的趨勢。不同級別的卵巢漿液性腺癌其發生機制可能不同，而在多種腫瘤發生中，WWOX及PTEN均表達下降或缺失，參與了腫瘤的形成[1]。該研究通過檢測卵巢漿液性腺癌中抑癌基因WWOX及PTEN的表達情況，探討卵巢癌基因治療的新靶點并探討其對預后的可能影響，方便選取2013年10月—2016年10月福州市第一醫院的手術切除并經病理確診的60例卵巢漿液性腺癌標本為研究對象，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取福州市第一醫院的手術切除并經病理確診的60例卵巢漿液性腺癌標本。患者年齡在 34～72歲之間，平均年齡 50歲。另選取正常卵巢組織30例作為對照。

1.2 方法

1.2.1 試劑 WWOX（C7）小鼠抗人單克隆抗體（稀釋度1：100）和PTEN（6H2.1） 小鼠抗人單克隆抗體（稀釋度1：100）分別購自 Santa Cruz 公司和福州邁新公司。

1.2.2 免疫組化 免疫組化染色采用 EliVision兩步法。按試劑盒說明書的具體操作步驟進行。陰性對照以PBS代替一抗，以正常卵巢組織作陽性對照。其中以蘇木精輕度復染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察。

1.2.3 結果判定 WWOX染色 以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性，PTEN染色：以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性。以陽性細胞百分比計分：陽性細胞數>75%計為4分，陽性細胞數50%～75%計為3分，陽性細胞數25%～50%計為2分，陽性細胞數<25%計為1分，沒有陽性細胞計為0分。以每張切片的大多數細胞染色特征來決定染色強度標準：出現棕黃色顆粒為3分，出現黃色顆粒為2分，出現淡黃色顆粒為1 分，無染 色為0分。兩項結果相加：0分：（-），2～3分：（+），4～5分：（++），6～7分：（+++）；（ +～+++）均為陽性。endprint

1.2.4 RT-PCR 采用異硫酸氰酸胍一步法提取組織總RNA；總RNA的鑒定；反轉錄合成cDNA；PCR反應；采用凝膠分析軟件（BIO-LD）進行定量，各組以目的基因與內參照基因GAPDH量的比值表示目的基因相對表達量。

1.2.5 統計方法 采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計學處理和分析，計量資料比較采用方差分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，并分別用（x±s）、[n（%）]表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WWOX 在卵巢漿液性腫瘤中的表達

檢測結果顯示，30例正常卵巢組織中WWOX免疫組化陽性化表達為90.0%（27/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中WWOX 免疫組化陽性率（48.7%），差異有統計學意義（P<0.05）。半定量 RT-PCR結果顯示卵巢漿液性腺癌中WWOX mRNA相對表達量為（0.23±0.05）顯著低于正常卵巢組織組（0.58±0.07）（P<0.05），見表1、圖1。

2.2 PTEN在卵巢漿液性腫瘤中的表達

PTEN的 免疫組化檢測結果顯示，30例正常卵巢組織中PTEN免疫組化陽性化表達為93.3%（28/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中PTEN陽性率（50.8%），差異有統計學意義（P<0.05）。卵巢漿液性腺癌中 PTEN mRNA相對表達量為（0.25±0.04），顯著低于正常卵巢組織組的（0.61±0.06）（P<0.05），見表2、圖2。

3 討論

近年來腫瘤研究中的熱點為癌基因的激活和抑癌基因的失活，而卵巢漿液性腺癌是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，具有預后差，病死率高的特點，因此該疾病一直是醫護人員關注的焦點[2]。2000年，由Bednarek應用鳥槍基因測序技術分離并鑒定出了一種WWOX基因，其基因定位于人類16q23.3～24.1的染色體上，且對整個常見染色體脆性位點FRA16D進行了跨越，蛋白質編碼共包含羧基末端的1個短鏈脫氧/還原酶結構域（SDR）和氨基端的2個WW結構域[3]。WWOX抑癌基因通過使酪氨酸33位點磷酸化而致功能活化，下調凋亡抑制因子，同時上調p53基因蛋白表達，使TNF細胞毒作用進行增強，并形成復合物，從而相互作用，起到抑制癌細胞的作用[4-6]。Nunez等[7]研究中顯示，正常卵巢組織中WWOX抑癌基因始終為強陽性表達，而卵巢癌中不僅組織分型中存在差異，且至少有37%減少或無法檢測出。該次研究結果顯示，30例正常卵巢組織中WWOX免疫組化陽性化表達為90.0%（27/30）。明顯高于60例漿液性腺癌中WWOX 免疫組化陽性率（48.7%），差異有統計學意義（P<0.05），卵巢漿液性腺癌中WWOX的免疫組化陽性率及mRNA相對表達量均顯著低于正常卵巢組織組，半定量 RT-PCR結果顯示卵巢漿液性腺癌中WWOX mRNA相對表達量為（0.23±0.05）顯著低于正常卵巢組織組（0.58±0.07），差異有統計學意義（P<0.05）。因此，該實驗認為WWOX基因表達缺失或降低可能在卵巢漿液性腺癌的發生、發展中發揮一定作用。

PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因之一[8]。主要表現為基因缺失、蛋白表達減少，可通過DNA甲基化以及基因突變等方式失活，調控細胞增殖，抑制細胞遷移，從而在腫瘤的發生、發展中發揮重 要作用[9]，因此PTEN基因失活在卵巢癌的發生中可能起一定的作用，可以認為PTEN 基因下調可能是卵巢癌發生的重要分子生物學基礎。實驗研究也表明，卵巢漿液性腺癌中PTEN基因的免疫組化陽性率及mRNA相對表達量均顯著低于正常卵巢組織組（P<0.05）。因此，該研究認為PTEN基因失活與卵巢癌的發生存在一定的重要關聯。

綜上所述，抑癌基因WWOX及PTEN可能會干擾卵巢癌細胞的細胞周期并抑制其生長增殖，臨床研究有待從分子調控等方面進一步深入探討，以期為今后的卵巢漿液性腺癌基因防治提供新的作用靶點，為卵巢漿液性腺癌的基因治療提供一種新方法。

[參考文獻]

[1] 焦丹，甘雨良，李軍.卵巢漿液性腺癌的超聲表現與其臨床病理特征相關性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2015（b22）：227-228.

[2] 邢曉靜，盧達新，谷小虎. CHD5和WWOX基因在胃癌中的表達及其對預后的影響[J].河北醫學，2015，21（9）：1409-1413.

[3] E Pluciennik，M Nowakowska，M Ga？dyszyńska， et al.The influence of the WWOX gene on the regulation ofbiological processes during endometrial carcinogenesis[J].International Journal of Molecular Medicine，2016，37（3）：807-815.

[4] Liu SY， Chiang MF and Chen YJ. Role of WW domain proteins WWOX in development， prognosis， and treatment response of glioma[J]. Exp Biol Med （Maywood） 2015（240）： 315-323.

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[6] Iiopoulos D，Guler G，Han SY，et al.Fragile genes as biomarkers ：epigenetic control of WWOX and FH IT in lung，breast and bladder cancer[J].Oncogene，2005，4（9）：1625-1633.

[7] Nunez MI ，Rosen DG，Ludes-Meyers JH，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlates with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64.

[8] PS Tanwar，G Mohapatra，S Chiang，et al.Loss of LKB1 and PTEN tumor suppressor genes in the ovarian surface epithelium induces papillary serous ovarian cancer[J]. Carcinogenesis ，2014，35（3）：546-553.

[9] Blanco-Aparicio C，Renner O，Leal J F，et al.PTEN，more than the akt pathway[J].Carcinogenesis，2007，28（7）：1379-1386.

（收稿日期：2017-08-25）endprint