基于分子模擬技術篩選大黃、羌活、秦艽的5—LOX、LTA4H抑制劑

谷宇+張栩+陳艷昆+趙博文+張燕玲

[摘要] 5-LOX（5-lipoxygenase）和LTA4H（leukotriene A4 Hydrolase）作為花生四烯酸代謝途徑中生成炎癥介質白三烯（LTs）的重要支路，是抗炎藥物研究的關鍵靶點。大黃、羌活、秦艽3味中藥具有明確的抗炎活性。該文以5-LOX，LTA4H靶點為研究載體，利用DS4.0（discovery studio）中的Hiphop模塊構建靶標抑制劑藥效團初步篩選3味中藥的成分數據庫，獲得5-LOX和LTA4H潛在活性成分。利用CDOCKER模塊進行進一步篩選藥效團初篩所得成分，基于原配體的打分值以及關鍵氨基酸建立篩選規則，最終得到5-LOX潛在活性抑制劑12個，包括原矢車菊素B2-3，3′-O-雙沒食子酸酯、revandchinone 2在內的大黃成分6個，包括二十二烷酸在內的羌活成分4個以及褐煤酸甲酯、N-二十二烷酮-O-氨基苯甲酸乙酯2個秦艽成分；得到LTA4H潛在活性抑制劑7個，包括大黃中的revandchinone 1，revandchinone 4，羌活中的二十三烷酸、二十四烷酸以及二十烷酸甲酯，秦艽中的褐煤酸甲酯、N-二十二烷酮-O-氨基苯甲酸乙酯。該研究能夠高效、低耗的篩選3味中藥的5-LOX、LTA4H潛在抑制劑，為發現3味中藥中發揮抗炎藥效的化學質量指標提供助力，以推動對于3味中藥的全程質量控制。

[關鍵詞] 抗炎； 5-LOX； LTA4H； 藥效團； 虛擬篩選； 分子對接； 中藥

[Abstract] 5-lipoxygenase （5-LOX） and leukotriene A4 hydrolase （LTA4H）， as the major targets of 5-LOX branch in the arachidonic acid （AA） metabolic pathway， play an important role in the treatment of inflammation. Rhei Radix et Rhizoma， Notopterygii Rhizoma et Radix and Genitana Macrophyllae Radix have clear anti-inflammation activities. In this paper， the targets of 5-LOX and LTA4H were used as the research carrier， and Hiphop module in DS4.0 （Discovery studio） was used to construct ingredients database for preliminary screening of three traditional Chinese medicines based on target inhibitor pharmacophore， so as to obtain 5-LOX and LTA4H potential active ingredients. The ingredients obtained in initial pharmacophore screening were further screened by using CDOCKER module， and the screening rules were established based on the score of initial compound and the key amino acids to obtain 12 potential 5-LOX inhibitors and 7 potential LTA4H inhibitors. To be more specific， the potential 5-LOX inhibitors included 6 ingredients in Rhei Radix et Rhizoma， such as procyanidins B2-3，3′-O-double gallate and revandchinone 2； four ingredients in notopterygium， such as dodecanoic acid and so on. On the other hand， potential LTA4H inhibitors included revandchinone 1， revandchinone 4 in Rhei Radix et Rhizoma， tridecanoic acid， tetracosanoic acid and methyl eicosanoate in Notopterygii Rhizoma et Radix， montanic acid methyl ester and N-docosanoyl-O-aminobenzoate in Genitana Macrophyllae Radix and so on. The molecular simulation methods were highly efficient and time-saving to obtain the potential inhibitors of 5-LOX and LTA4H， which could provide assistance for discovering the chemical quality indicators of anti-inflammatory efficacy of three Chinese herbs， and may be helpful to promote the whole-process quality control of three Chinese herbs.endprint

[Key words] anti-inflammatory； 5-lipoxygenase； leukotriene A4 hydrolase； pharmacophore； virtual screening； molecular docking； traditional Chinese medicine

花生四烯酸（AA）代謝途徑是生物體內廣泛存在并具有強大生物活性的代謝體系，與生物體內炎癥反應具有直接聯系，花生四烯酸的代謝主要通過2條通路：①在環氧化酶（cyclooxygenase，COX）作用下生成前列腺素（prostaglandin，PGs）；②在脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）作用下生成白細胞三烯（leukotrienes，LTs）、脂質過氧化物。其中代謝途徑中的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）、白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）是抗炎類藥物設計的重要靶標。

5-脂氧合酶（5-LOX）通路是花生四烯酸代謝途徑中的一條重要支路，其終產物白三烯（LTs）是參與炎癥反應的重要炎癥介質[1]。在這條通路上，5-LOX在激活蛋白的協助下催化AA生成白三烯A4（LTA4），在白三烯A4水解酶（LTA4H） 的催化下產生白三烯B4（LTB4），LTB4 是生物體內最強的白細胞趨化因子之一[2]，可以通過激活并聚集許多炎性和免疫細胞 [3-5]引發類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）病人關節腫痛、骨質破壞等炎癥反應；通過誘導溶酶體酶與活性氧的釋放介導血管損傷，參與系統性紅斑狼瘡皮膚、腎臟等組織的炎癥反應及組織損傷[6]。因此，5-LOX及LTA4H作為花生四烯酸代謝途徑中的重要靶標，研究5-LOX，LTA4H的雙效抑制劑對抗炎類藥物設計具有重要的研究意義。

中藥在治療炎癥方面具有廣泛的應用，例如大黃、羌活和秦艽這3味具有抗炎潛在活性的西北特色中藥材。大黃藥性寒涼，清熱解毒、抗炎鎮痛作用良好，對動脈粥樣硬化急性膽囊炎、胰腺炎、腹膜炎及心血管炎癥等治療效果明顯[7-8]；羌活辛散祛風、味苦燥濕、性溫散寒，具有祛風勝濕止痛的功效，主治風寒濕痹肢節疼痛，研究表明羌活水煎液具有顯著的抗炎鎮痛作用[9]；秦艽具有祛風濕、止痹痛、退虛熱、清濕熱等功效，用于風濕痹痛、筋脈拘攣、骨節酸痛、中風手足不遂及骨蒸潮熱、小兒疳積發熱、濕熱黃疸等病癥[10]。研究表明，秦艽醇提物能顯著減輕佐劑性關節炎大鼠關節腫脹，降低關節炎指數，改善關節滑膜增生[11]。然而，現行藥典中制定的針對以上3味中藥材的質量指標成分較為單一，量效關聯差，對于其治療炎癥的具體療效指向尚不明確。因此，需要發現上述3味中藥具有潛在抗炎活性的指標性成分，以推動3味西北特色中藥材的全程質量控制。

本研究以大黃、羌活和秦艽作為研究載體，從中藥成分數據庫中搜集以上3味中藥化學成分構建中藥成分數據庫。隨后利用已知的 5-LOX和LTA4H抑制劑分別構建Hiphop藥效團模型，結合分子對接技術分別對中藥成分數據庫中的成分進行虛擬篩選，發現潛在的具有5-LOX和LTA4H抑制活性的化學成分，并在一定程度上闡釋其針對2個靶標的作用機制。

1 材料與方法

1.1 3味中藥成分數據庫

基于多個中藥化學成分數據庫，包括TCMdb2009數據庫（ traditional Chinese medicine database，TCMD）、CVDHD 數據庫[12] （cardiovascular disease herbal database）、臺灣中醫藥資料庫[13]（TCM database@Taiwan），以及關于3味中藥的相關文獻[14-16]，建立了3味中藥的成分數據庫，以備篩選所用。所建數據庫中包含大黃成分226個、羌活成分133個、秦艽成分55個。其中包括大黃中的大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素，秦艽中的秦艽酰胺、櫟癭酸以及羌活中的γ-氨基丁酸、去氫羌活內酯等3味中藥中具有代表性的藥效成分。

1.2 藥效團研究

1.2.1 藥效團數據來源 在Binding Database（http： //www. bindingdb.org/）中分別輸入靶標名稱5-lipoxygenase和leukotriene A4 hydrolase。其中檢索得到對人源5-LOX具有抑制活性的化合物508個，對人源LTA4H具有抑制活性的化合物535個。分別優選其中結構差異性大且具有一定活性梯度的化合物作為訓練集，其中5-LOX抑制劑藥效團訓練集含有18個化合物，LTA4H抑制劑藥效團訓練集含有16個化合物。5-LOX與LTA4H訓練集化合物的結構與IC50分別見圖1，2。從5-LOX與LTA4H各自剩余化合物中分別隨機選取活性化合物100個，與來源于Drugbank中的300個非活性化合物共同組成2個靶標藥效團的測試集。

1.2.2 藥效團模型的構建 利用Discovery Studio 4.0（DS 4.0）對訓練集和測試集化合物進行構象分析，采用BEST方法，能量閾值為20 kcal·mol-1，最大構象數目為255個。分別選取訓練集中抑制活性高且結構差異較大的化合物，Principal值設為2，MaxOmitFeat值設為0，表明這些化合物分子活性相對較強，在藥效團產生過程中應當作模板分子來進行重點考慮，所產生的藥效團模型每個特征都必須與這些化合物匹配；選取其中抑制活性一般的化合物，Principal值設為1，MaxOmitFeat值設為1，表明這些分子活性一般，在藥效團產生過程中重要性也一般，所得到的藥效團模型藥效特征與這些化合物部分匹配；選取其中活性極低的2個化合物，Principal值設為0，MaxOmitFeat值設為2，表明這2個化合物在藥效團模型產生過程中不會被考慮在內，只用于選擇性地定義排除體積。選中訓練集中Principal值設為2的化合物，生成藥效特征元素，識別結果包括氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，A）、疏水基團（hydrophobic region，H）、氫鍵供體（hydrogen bond donor，D）、正電中心（positive ionizable，PI）、芳環（ringaromatic，R）5類藥效特征。基于藥效特征識別結果，利用以上5類特征元素進行組合生成藥效團模型，生成排除體積（maximum excluded volumes，EV）個數設置為3，LTA4H設置為5。endprint

1.2.3 藥效團模型的評價驗證 利用測試集對構建的模型進行驗證，根據3個評價指標選擇最優的藥效團模型，分別是活性化合物有效命中率（HRA）、辨識有效性指數（IEI）、綜合評價指數（CAI） [17]。

HRA值越高說明所得到的藥效團識別活性化合物的能力越強；IEI值越大說明所得到的藥效團辨識活性化合物和非活性化合物的能力越強；CAI值越高說明所得到的三維藥效團的數據庫搜索能力越好。

1.2.4 數據庫的初步篩選 從DrugBank數據庫 （https：//www.drugbank.ca/）中分別檢索得到針對5-LOX和LTA4H具有抑制活性的上市藥物作為陽性藥，下載其化合物3D結構并與最優藥效團進行匹配。采用2個靶標的最優藥效團模型對大黃、羌活和秦艽3味中藥成分數據庫進行初步篩選，搜索模式為Best Search，匹配模式為柔性匹配，其余為默認參數。最終保留與最優藥效團完全匹配且匹配值高于抑制活性最高陽性藥的化合物用于分子對接研究。

1.3 分子對接研究

1.3.1 分子對接數據來源 2個靶標的蛋白三維結構從PDB數據庫（http： //www.rcsb.org）中下載獲得，優先選擇解析度較高、復合抑制劑且來源為人源的晶體結構作為研究載體，最終確定PDB代碼分別為3V99和2R59的蛋白晶體結構作為5-LOX和LTA4H的分子對接晶體結構。隨后對晶體結構進行以下處理：刪除多余蛋白質構象、刪去水分子、補全不完整殘基、加氫以及分配相關電荷。處理后的蛋白用于分子對接研究。

1.3.2 原配體與藥效團初篩所得化合物的對接研究 基于晶體復合物中的原配體定義活性口袋，抽出原配體，分別用DS4.0中的Libdock與CDOCKER方法將原配體對接到各自的活性口袋中，計算初始復合物中原配體的分子構象與對接后的分子構象的均方根偏差（RMSD），若RMSD<2.0，則證明對接所得分子構象可以在一定程度上還原配體與受體的結合模式，從而證明所選擇的對接方法與參數設置具有合理性。將藥效團模型篩選得到的化合物對接進入先前定義好的活性口袋中，以原配體與受體對接打分值的80%作為閾值，選擇對接打分值高于閾值且作用模式與原配體-受體作用模式近似的化合物作為靶標的潛在抑制劑。

2 結果與討論

2.1 5-LOX藥效團

基于訓練集化合物計算得到10個HipHop藥效團模型，打分值（Rank）在150～154，除Model4具有3個H，其余模型均具有2個A、2個H、1個EV，模型信息和評價結果見表1。Model1命中活性化合物94個，其有效活性命中率最高，其IEI值最高為2.474，CAI值最高為2.349，表明其搜索得到的三維藥效團的數據庫搜索能力越好。因此 Model1被選為最優模型，用來篩選3味中藥成分數據庫。此外，最優藥效團模型可與陽性藥完全匹配，匹配信息見表2，其中匹配值最高的為馬索丙考（masoprocol），匹配結果見圖3。

2.2 LTA4H藥效團

基于訓練集化合物計算得到10個HipHop藥效團模型，打分值（Rank）在174～186。均具有2個A、2個H、3個EV，模型信息和評價結果見表3。Model1命中活性化合物99個，其有效活性命中率最高，其IEI值最高為2.623，CAI值最高為2.596，表明其搜索得到的三維藥效團的數據庫搜索能力越好。因此 Model1被選為最優模型，用來篩選3味中 藥成分數據庫。此外，最優藥效團模型可與陽性藥完全匹配，匹配信息見表2，其中匹配值最高的為（2S）-2-氨基-5-氧代-5-[（4-苯基甲氧基苯基）氨基]

2.3 3味中藥成分數據庫初步篩選

利用5-LOX抑制劑的最優藥效團模型篩選大黃、羌活和秦艽3味中藥成分數據庫，共篩得大黃成分76個、羌活成分66個、秦艽成分23個，保留其中Fitvalue值高于最優陽性藥（0.896 143）的化合物，用于進一步的分子對接研究。其中預測活性較高化合物茜素已有文獻報道具有明確的抗炎活性，可抑制結締組織滲透性[12]；化合物4-松油醇已有文獻報道可抑制脂多糖活化的人外周血單核細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10，具有平喘的作用[13]，證 明模型具有一定的可靠性。

利用LTA4H抑制劑的最優藥效團模型篩選3味中藥成分數據庫，共篩得大黃成分73個、羌活成分62個、秦艽成分17個，保留其中Fitvalue值高于 最優陽性藥（0.890 381）的化合物，用于進一步的分子對接研究。

2.4 分子對接

2.4.1 5-LOX分子對接篩選 利用5-LOX所選晶體結構的原配體定義活性口袋，其活性口袋信息及計算結果見表4。將篩選得到的具有類藥性質且Fitvalue值高于最優陽性藥的化合物進行分子對接研究，將具有類藥性質且匹配度在0.896 143以上的165個潛在活性化合物對接到活性口袋中，根據均方根偏差較低的原則，選擇CDOCKER進行對接，對接閾值為44.74，以化合物打分值高于閾值，且與關鍵氨基酸發生相互作用為篩選原則，篩選得到6個大黃成分、羌活成分4個、秦艽成分2個篩選結果見表5。

大黃中的成分revandchinone 2與5-LOX中的ASN554和ALA672形成氫鍵相互作用，與VAL178、LEU607、PHE610形成疏水性相互作用；羌活中的14-甲基十六烷酸與5-LOX中的VAL671、ALA672形成氫鍵相互作用，與HIS372形成疏水性相互作用；秦艽中的大葉苷C與5-LOX中的ASN554、VAL671、ALA672形成氫鍵相互作用，與HIS367、LEU368、HIS372、ALA410形成疏水性相互作用，見圖5～7。以上3味中藥對應的3種成分均與ALA672發生氫鍵相互作用，revandchinone 2和大葉苷C均與ASN554形成氫鍵相互作用，14-甲基十六烷酸和大葉苷C均與VAL671形成氫鍵相互作用。因此，可以將ASN554、VAL671、ALA672視為配體與5-LOX相互作用發揮抑制活性的關鍵氨基酸。endprint

2.4.2 LTA4H分子對接篩選 利用LTA4H所選晶體結構的原配體定義活性口袋，其活性口袋信息及計算結果見表4。將篩選得到的Fitvalue值高于陽性藥（0.890 381）的化合物進行分子對接研究，將具有類藥性質且匹配度在0.890 381以上的152個潛在活性化合物對接到活性口袋中，根據均方根偏差較低的原則，選擇CDOCKER進行對接，對接閾值為61.90，以化合物打分值高于閾值，且與關鍵氨基酸發生相互作用為篩選原則，篩選得到2個大黃成分、3個羌活成分、2個秦艽成分，篩選結果見表6。

大黃中的成分revandchinone 4與LTA4H中的GLY345、SER380、GLU384發生氫鍵相互作用，與PHE314、LEU369、PRO374、LYS565發生疏水性相互作用；羌活中的二十三烷酸與LTA4H中的TYR267、GLY268、ARG563發生氫鍵相互作用，與ALA137、TYR378發生疏水性相互作用；秦艽中的褐煤酸甲酯與LTA4H中的ARG537、LYS565發生氫鍵相互作用，與PHE314、VAL367、PRO382發生疏水性相互作 用，見圖8～10。

3 結論

隨著研究技術的不斷進步，AA及其代謝產物在炎癥反應中的作用逐漸被發現，是治療炎癥引發的相關疾病的重點研究對象。其中，5-LOX通路可以誘發炎癥的級聯反應，是AA代謝通路中的重要分支，其中涉及的關鍵酶，包括5-LOX和LTA4H均為治療炎癥誘發的類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化等疾病的關鍵靶點。

本文通過構建5-LOX抑制劑和LTA4H抑制劑的Hiphop藥效團模型，初步篩選了大黃、羌活、秦艽3味中藥成分數據庫，選擇匹配值大于陽性藥的成分進行分子對接研究，將對接CDOCKER打分值大于原配體打分值的80%的成分作為靶標的潛在活性抑制劑。綜合考慮藥效團匹配值、分子對接打分值和成分與靶標之間的相互作用，選擇了6個大黃成分、4個羌活成分和2個秦艽成分作為5-LOX的潛在抑制劑；2個大黃成分、3個羌活成分和2個秦艽成分作為LTA4H的潛在抑制劑。針對5-LOX、LTA4H 2個靶標，大黃中的revandchinone 4，羌活中的二十三烷酸、二十四烷酸，以及秦艽中的褐煤酸甲酯這4個成分均具有較高的藥效團匹配值和分子對接打分值，可作為5-LOX、LTA4H的雙效抑制劑，有望成為抗炎新藥研發的先導化合物。本研究高效、低耗的篩選了3味中藥的5-LOX、LTA4H潛在抑制劑，為發現3味中藥中發揮抗炎藥效的化學質量指標提供助力，對于推動3味中藥的全程質量控制具有一定的現實意義。

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[責任編輯 孔晶晶]endprint