水培條件下氮素對擬巫山淫羊藿產量和黃酮類成分的影響

張云風+郭寶林+楊相波+李礫+姜志海+莫玉敏

[摘要] 采用水培方法研究了不同氮濃度和氮素形態及配比對擬巫山淫羊藿產量和黃酮類成分的影響。氮濃度設7個處理組N0～N6，分別為0，2.5，5.0，7.5，10.0，13.0 mmol·L-1；氮形態設5個處理組T1～T5，硝銨比NO3-N/NH4-N依次為5∶0，4∶1，2.5∶2.5，1∶4，0∶5，總施氮量為5 mmol·L-1。結果表明，隨氮濃度的增大，擬巫山淫羊藿的生物量和葉干重均顯著升高，N5組的生物量和葉干重分別比N0組和N4組高29%，23%和36%，23%（P<0.05），但與N6組差別不顯著；根，莖干重變化不明顯。凈光合速率及各光合色素含量在N3～N5組中較高。朝藿定A，B，C，淫羊藿苷及總黃酮含量在N3組最低，N4組突然升高，N4～N6組變化不大，朝藿定C的含量最高的N5組比含量最低的N3組高131%（P<0.05）。在不同硝銨比處理組中，生物量，單株葉干重，莖干重在硝銨比為2.5∶2.5時最大，單純施用硝態氮（T1）和銨態氮處理（T5）最低（二者差異不顯著）；各光合色素含量和凈光合速率在T3和T4組最低，其他3組較高。氮形態對黃酮含量的影響遠小于氮濃度的影響。朝藿定C的含量在T1組中最高，但僅比T2～T5組高5%～8%（P<0.05），其他4組間差異不明顯。朝藿定A，B，淫羊藿苷及總黃酮含量在T1組中均較高，在T2組中最低，T1組分別比T2組高41%，62%，27%（P<0.05）。擬巫山淫羊藿為高氮耐受性植物，10.0 mmol·L-1是其生長轉向良好的拐點，最適的氮濃度為10.0～13.0 mmol·L-1，喜好硝態氮和銨態氮混施，最適的氮形態及配比為2.5 mmol·L-1硝態氮+2.5 mmol·L-1銨態氮。

[關鍵詞] 擬巫山淫羊藿； 氮濃度； 氮形態； 產量； 黃酮

[Abstract] Nitrogen nutrition divided into concentrations and forms for Epimedium pseudowushanense was studied under hydroponic conditions. There were 7 nitrogen concentrations treatments（N0-N6）which nitrogen concentration was 0， 2.5， 5.0， 7.5， 10.0， 13.0 mmol·L-1， respectively， and 5 nitrogen forms and proportions treatments （T1-T5） which NO3-N/NH4-N was 5∶0， 4∶1， 2.5∶2.5， 1∶4， 0∶5 respectively， the total nitrogen applied was 5 mmol·L-1. The results showed that along with the increase of nitrogen concentration， biomass （dry weight） and leaf dry weight increased， which in N5 treatment was 29%， 23% higher than those in N0 and 36%， 23% higher than those in N4 respectively， but not significantly different from N6 treatment. Roots and stem dry weights did not change significantly. Pn and the contents of photosynthetic pigments were higher in N3-N5 treatments. Epimedin A， B， C， icariin and total flavonoids contents were the lowest in N3 treatment， suddenly increase in N4 treatment and only a little change between N4-N6 treatments. N5 treatment with the highest epimedin C content was 131% higher than N3 treatment with the lowest epimedin C content （P<0.05）. While in the nitrogen forms and proportions treatments， biomass， leaf and stem dry weights were the highest in T3 treatment and lower in T1 and T5 treatments， without significance between T1 and T5 treatments. These indicators in T3 treatment were more than 30% higher than those in T1 treatment. The impact of nitrogen concentrations was greater than nitrogen forms on flavonoids. epmedin C content was the highest in T1 treatment， only 5%-8% higher than that in T2-T5 treatments （no significance between 4 treatments）. Epimedin A， B， icariin and total flavonoids contents were higher in T1 treatment， the lowest in T2 treatment， those in T1 treatment was 41%， 62% and 27% higher than T2 treatment respectively （P<0.05）. In a conclusion， E. pseudowushanense is a high nitrogen tolerant plant， 10.0 mmol·L-1 was the boundary point between growing general to well and the optimal nitrogen concentration for it was 10.0-13.0 mmol·L-1. Besides， it prefers to grow in NO-3 plus NH+4 and the optimal proportion was 2.5∶2.5.endprint

[Key words] Epimedium pseudowushanense； nitrogen concentrations； nitrogen forms； yields； flavonoids

擬巫山淫羊藿Epimedium pseudowushanense B. L. Guo是小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，主要分布于貴州黔東南州。因其葉形態和藥材品質與巫山淫羊藿相似，一直被誤作為巫山淫羊藿E. wushanense T. S.Ying使用，擬巫山淫羊藿中朝藿定C和其他淫羊藿苷類成分含量較巫山淫羊藿高且質量穩定，現代藥理學研究表明朝藿定C具有與淫羊藿苷類似的作用[1-4]。目前淫羊藿藥材資源主要來自于野生，隨著用量大幅增加和破壞性采挖，野生資源蘊藏量逐年銳減，急需實現栽培化。擬巫山淫羊藿經十多年的引種馴化，目前在貴州省黔東南州雷山縣初步實現了規?；N植，是淫羊藿屬中首個實現大面積人工種植的物種，但其營養需求規律尚需系統研究。本研究組在對擬巫山淫羊藿生長地土壤理化狀況調查分析中發現，氮素對擬巫山淫羊藿的葉產量有顯著影響[5]。本文利用水培方式就氮素濃度和氮素形態對擬巫山淫羊藿生長指標和黃酮類成分含量的影響開展研究。

1 材料

1.1 儀器與試劑

自制水培盆；通氣泵（SB-248，中山市松寶電器有限公司）；pH計（ST300，奧豪斯儀器（常州）有限公司）；光合儀（LI-6400XT，美國LI-COR公司）；熒光儀（Dual-Pam-100，德國WALZ公司）；高效液相色譜儀（Flexar FX-15，美國PE公司）；紫外-可見光分光光度計（島津UV2550，日本島津制作所）；分析天平（FA2014N型，上海精密科學儀器有限公司）；循環式真空泵（CA-1111，上海愛朗儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司）。

純凈水（娃哈哈）；甲醇（色譜純，fisher公司）；乙腈（色譜純，fisher公司），無水乙醇（分析純，北京化工廠）；硝酸鈣、硝酸鉀、氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸亞鐵、EDTA（分析純，天津市光復科技發展有限公司）。對照品朝藿定A、B、C，淫羊藿苷及鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ均由本實驗自制，純度均大于98%。

1.2 植物樣品

一年生擬巫山淫羊藿實生苗，采自貴州雷山栽培基地的同一塊種植地，經郭寶林教授鑒定為擬巫山淫羊藿E. pseudowushanense。試驗于2016年10月至12月在藥用植物研究所北京溫室培養間進行，溫度20 ℃左右，光照強度為63 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%，每日光照16 h，黑暗8 h。

2 方法

2.1 實驗設計

首先將苗栽種在盛有25% Hoagland營養液的塑料盆（6 L）中進行緩苗。1周后長出新根，再從其中選取生長良好且大小一致的實生苗，隨機均分為12個組。試驗包括2部分，氮濃度試驗和氮素形態及配比試驗。每個培養盆為1個處理，共30株，包含3個重復，每個重復10株。

氮濃度（硝態氮）試驗設有7個處理：0 mmol·L-1（N0），1.0 mmol·L-1（N1），2.5 mmol·L-1（N2），5.0 mmol·L-1（N3），7.5 mmol·L-1（N4），10.0 mmol·L-1（N5），13.0 mmol·L-1（N6），各處理所用營養液中H2PO4-的濃度為0.25 mmol·L-1，K+的濃度為5.0 mmol·L-1，Ca2+的濃度為4.0 mmol·L-1，其他元素及鐵鹽均與100% Hoagland營養液相同。

氮形態和配比試驗設有5個處理，硝銨比NO3-N/NH4-N依次為5∶0（T1），4∶1（T2），2.5∶2.5（T3），1∶4（T4），0∶5（T5），總施氮量為5 mmol·L-1。各處理所用營養液中除氮以外的其他元素及鐵鹽均與100% Hoagland營養液相同。

每3 d調1次pH（6.00± 0.03），每10 d更換1次營養液。連續處理2個月后對擬巫山淫羊藿進行各項指標的測定。

2.2 取樣

從每個處理的每個重復隨機挑選3株植物，取內側成熟葉片，進行光合參數測定；從每個重復每株取1枚新鮮的成熟葉片，剪碎后混勻，測定光合色素含量；10株苗于105 ℃殺青，80 ℃烘干，稱量根、莖、葉及全株干重，成熟葉片混合粉碎，測定黃酮類成分、可溶性糖及可溶性蛋白含量。

2.3 測定項目

2.3.1 光合色素的測定 參照文獻[6]。

2.3.2 淫羊藿苷類黃酮的測定 樣品溶液的制備：精密稱定過3號篩的干燥樣品約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密量取30 mL 50%乙醇，稱重，超聲提取1 h，放冷，再稱重，用50%乙醇補足失重，搖勻，用0.22 μm濾膜過濾，取續濾液，即得。

對照品溶液的制備：精密稱取各對照品，分別配制成朝藿定A 1.361 g·L-1，朝藿定B 1.163 g·L-1，朝藿定C 2.012 g·L-1，淫羊藿苷1.887 g·L-1，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ 0.991 g·L-1的對照品溶液。

色譜條件：Agela Technologies Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～25 min，25%～27%A；25～30 min，27%～80%A；30～35 min，80%～100%A）；流速 1.0 mL·min-1；柱溫 35 ℃；檢測波長 270 nm；進樣量 10 μL。色譜圖見圖1。

2.3.3 光合特性指標測定 于上午8：00—11：30測定葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間二氧化碳濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。樣本室內氣體流速200 μmol·s-1，葉室CO2濃度600 μmol·mol-1，溫度20 ℃，相對濕度53%。紅藍光源，葉室光合有效輻射為63 μmol·m-2·s-1。endprint

2.3.4 可溶性蛋白和可溶性糖的測定 采用改良的考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[7]，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[8]。

2.4 數據分析

試驗數據采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行統計分析，不同處理間的差異采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan進行。

3 結果與分析

3.1 HPLC方法學考察

3.1.1 線性關系 分別精密吸取2.3.2項下的各對照品溶液1.0，2.0，5.0，8.0，12.0，15.0，18.0，20.0 μL，按2.3.2項下色譜條件進樣，測定峰面積。以峰面積為橫坐標（x），進樣質量（μg）為縱坐標（y）繪制標準曲線，見表1。

3.1.2 精密度 取2.3.2項下的供試品溶液，在2.3.2項色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜峰面積，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ峰面積的RSD分別為 1.8%，1.8%，2.0%，1.4%，2.0%。

3.1.3 重復性 按2.3.2項下方法操作，制備同一 供試品溶液6份，在2.3.2項下色譜條件下測定，記錄峰面積，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.79%，2.4%，2.5%，2.9%，2.6%。

3.1.4 加樣回收率 精密稱定6份已測定含量的擬巫山淫羊藿樣品，每份約0.1 g，加入與0.1 g該樣品含量相等的5種對照品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液。在2.3.2項色譜條件下進樣，記錄色譜峰面積，計算回收率，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的回收率和RSD分別是99.74%，1.2%；100.1%，0.92%；100.2%，0.88%；99.91%，1.2%；100.1%，0.92%。

3.2 氮濃度對擬巫山淫羊藿的影響

3.2.1 不同氮濃度對擬巫山淫羊藿生長及生化指標的影響 不同氮濃度顯著影響了擬巫山淫羊藿的單株葉干重及單株生物量（干重）。葉干重隨氮濃度的增大而增加，N5，N6組顯著高于N0～N4組（P<0.05），但N5，N6 2組間和N0～N4 4組間均無明顯差異，N5組分別比N0，N4組高35.71%，22.58%。莖干重、根干重及根冠比隨不同氮濃度的變化不明顯，生物量隨氮濃度增大的變化趨勢與葉干重相似，可溶性糖及可溶性蛋白的含量隨不同氮濃度變化不明顯，見表2。

3.2.2 不同氮濃度對擬巫山淫羊藿光合色素含量及光合參數的影響 N0組中葉綠素a的含量最低，N1～N2組較高，N3組最高，N4～N6僅次于N3組（P<0.05），N3組比N2組高33.91%。葉綠素b、葉綠素總量（葉綠素a+葉綠素b）及類胡蘿卜素的含量隨不同氮濃度的變化趨勢與葉綠素a相似，即光合色素的含量隨氮濃度增加大體呈增大趨勢，見表3。

擬巫山淫羊藿的Pn隨氮濃度增大呈逐漸增大趨勢，N0組的Pn最小，N1，N2的Pn僅高于N0組（P<0.05）；N3～N5組的Pn較大，顯著高于N0～N2組；N6組的Pn最大（P<0.05），比N1組高28.36%。整體來看N3～N6組的Pn較大，而N0～N2組的Pn較小。不同氮濃度對Ci也有影響：N3～N6組的Ci較大，而N0～N2組的Ci較小，但差異并不顯著。不同氮濃度對Gs及Tr影響不明顯。

3.2.3 不同氮濃度對擬巫山淫羊藿黃酮類成分含量的影響 不同氮濃度對擬巫山淫羊藿中不同黃酮化合物的含量均有顯著影響，見表4。

朝藿定C的含量在N5組中最高，在N3組中最低（P<0.05），N5組比N3組高130.69%。整體看來，朝藿定C的含量在N4～N6組均較高；N0，N1組居中；N2，N3組的含量最低，N0組比N3組高69.31%（P<0.05）。朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷及總黃酮含量（5種黃酮的含量之和）變化與朝藿定C的變化相似，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ含量變化不同，隨氮濃度增大而降低。

不同氮濃度對朝藿定C和總黃酮的產量的影響與對朝藿定C含量的影響幾乎一致。

3.3 氮形態對擬巫山淫羊藿的影響

3.3.1 不同氮素形態對擬巫山淫羊藿生長及生化指標的影響 不同氮素形態及配比顯著影響了擬巫山淫羊藿的單株葉干重、莖干重、根干重、生物量及根冠比，見表5。

葉干重隨硝銨比的減小呈先增大后減少趨勢。T3組中葉干重最高（P<0.05），比T1組高38.42%，T1和T5組中單株葉干重較低，顯著低于其他各組（P<0.05）。莖干重和生物量隨不同硝銨比減小的變化趨勢與葉干重一致。不同氮素形態及配比對根干重也有明顯影響。T1和T3組的根干重無顯著差別，T3組分別比T2，T4，T5組高34.76%，28.70%，59.40%，T2，T4，T5 3組間無明顯差異。根冠比隨硝銨比的減小大體呈降低趨勢，T1組比T5組高48.39%。

擬巫山淫羊藿中可溶性糖及可溶性蛋白的含量隨不同氮素形態及配比的變化不明顯。

3.3.2 不同氮素形態及配比對擬巫山淫羊藿光合色素含量及光合參數的影響 擬巫山淫羊藿中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量隨硝銨比減小均呈先降低后升高趨勢，其中T3，T4組各色素含量最低（P<0.05），T1，T2，T5組間各色素含量的差異不明顯，但均顯著高于T3，T4組（P<0.05），T1組中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素的含量分別比T3組高11.31%，9.23%，11.15%，8.77%，見表6。

不同氮素形態及配比對擬巫山淫羊藿Pn影響較大。Pn由大到小依次為T1，T2（二者無明顯差異）>T5>T3>T4，T2組比T4組高62.38%。不同氮素形態及配比對Ci也有較大影響。T1，T5組的Ci最低，T2，T3，T4組中Ci最高，二者有顯著性差異（P<0.05）。endprint

3.3.3 不同氮素形態及配比對擬巫山淫羊藿黃酮類成分含量的影響 氮素形態及配比的差異對不同黃酮化合物含量的影響不一，見表7。朝藿定C的含量在T1組中最高，但僅比T2～T5組高4.99%～8.27%（P<0.05），T2～T5 4組間差異不明顯。朝藿定A、B，淫羊藿苷及總黃酮含量在T1組中均較高，在T2組中最低，T1組分別比T2組高41.18%，62.07%，26.67%（P<0.05）。而鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量隨硝銨比減小而降低。

朝藿定C及總黃酮的產量隨硝銨比減小呈增大—減小趨勢，T3和T4組產量最高（組間無明顯差異），T1和T5組含量最低（組間無明顯差異），T3組中朝藿定C及總黃酮的產量分別比T1組高26.67%，25.47%。

4 討論與結論

4.1 氮濃度和氮形態對生長發育的影響

大量研究表明，植物的生長發育和產量的形成需要適宜的氮肥量。不同植物對施氮量的響應不一，大體可分為2種類型：一種是對高氮敏感的植物，表現為產量隨施氮量的增大呈增長-快速降低的趨勢，如蕎麥[9]、黃芪[10]、杭白菊[11]等；另一種是高氮耐受植物，產量隨施肥量的增大呈增長-平臺-降低的趨勢，如廣藿香[12]、廣金錢草[13]、蘆薈[14]等。在本試驗條件下，擬巫山淫羊藿的葉干重及生物量隨氮濃度增大而增加，10.0 mmol·L-1是其生長由一般向良好轉變的拐點，繼續增大氮濃度到13.0 mmol·L-1，葉干重和生物量變化不明顯，故推測擬巫山淫羊藿屬于高氮耐受型植物。這與前期對貴州擬巫山淫羊藿生長地的土樣調研的結果一致。此外，其他學者[15-16]在對柔毛和巫山淫羊藿的研究中得到類似結果。

氮是葉綠素的重要組成成分，缺氮會抑制葉綠素的合成，適宜氮肥會促進各光合色素的形成。光合色素參與光合作用光能的吸收、傳遞和轉化等重要環節，對光合作用有十分重要的影響。在本實驗中，各光合色素含量及凈光合速率隨施氮量的變化趨勢相似，二者在N0組最低，在N3～N6組較高。這與前人在青岡櫟容器苗[17]、玉米[18]等植物上的研究結果一致。

不同植物在長期進化中形成了對不同氮素形態的偏向性。大量研究表明，多數植物在硝態氮和銨態氮混施時生長良好，如油麥[19]、川芎[20]、半夏[21]等。也有許多植物在硝態氮中生長良好，如菠菜[22]、黃瓜[23]等。然而對于分布在酸性土壤上的杜鵑花科的蔓越橘[24]和長期生長在水漬環境中的水稻[25]、黑麥草[26]等植物而言，銨態氮是比硝態氮更好的氮源。只有極少數植物在純銨態氮和純硝態氮環境中均能生長良好，如甜菜、棉花、高粱[27]等。對于擬巫山淫羊藿來說，最適的氮形態為2.5 mmol·L-1硝態氮+2.5 mmol·L-1銨態氮，此時植物葉、莖、根干重均最大。純硝態氮及純銨態氮處理下，光合色素含量及光合速率較高，而生物量卻不高，這可能與葉片較小和增厚有關。

4.2 氮濃度和氮形態對淫羊藿苷類黃酮成分的影響

氮濃度對黃酮類含量有明顯影響。朝藿定C的含量在N4組中較N3組有突然升高，并在N5組又有升高，含量最高的N5組比含量最低的N3組高130.69%（P<0.05），無氮的N0組和低氮組（N1，N2組）的朝藿定C含量也高于N3組，N0組比N3組高69.31%（P<0.05）。不同氮濃度對朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷及總黃酮含量的影響與朝藿定C相似，然而鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量隨氮濃度增大而降低。其他學者報道低氮會使番茄葉片中槲皮素、山柰酚及鼠李素的含量升高[28]，小蕁麻葉片[29]中槲皮素類化合物含量升高。這與5種黃酮類成分在0～5 mmol·L-1隨氮濃度增加大體呈降低的結果相似。5種黃酮類成分在7.5～13.0 mmol·L-1較高，這與其他學者在枸杞[30]、黃芩[31]及蒔蘿[32]中的研究結果相似，這可能與植物自身的營養特性有關，也可能與次生代謝物復雜的合成、調控過程有關，但相關機制尚不清楚，有待進一步研究。

氮形態對黃酮含量的影響遠小于氮濃度的影響。朝藿定C的含量在T1組中最高，但僅比T2～T5組高4.99%～8.27%（P<0.05），其他4組間差異不明顯。朝藿定A，B、淫羊藿苷及總黃酮含量在T1組中均較高，在T2組中最低，T1組分別比T2組高41%，62%，27%（P<0.05）。而鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量隨硝銨比減小而降低。純硝態氮下5中黃酮成分含量均最高的原因可能與此時植物葉干重最低引起的濃縮效應有關，但具體機制仍需進一步研究。朝藿定C和總黃酮的產量隨硝銨比的減小呈增大—減小趨勢，T3，T4組產量最高（2組間無明顯差異）。

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[責任編輯 呂冬梅]endprint