川西高原產生物堿暗紫貝母內生放線菌的篩選、鑒定及抑菌活性的測定

陳靜+它現此祖+曾紅+李曾燕+王芳+劉松青

[摘要] 為挖掘野生暗紫貝母內生菌資源，緩解貝母資源的緊缺，采集生長于川西高原的野生暗紫貝母為試驗材料，取其健康鱗莖，通過純培養法、插片法、薄層色譜分析技術和牛津杯法觀察內生放線菌菌絲形態，研究放線菌產生物堿的能力及其所產生物堿的抑菌活性。結果通過改良高氏一號培養基分離得到14株內生放線菌，基于顏色反應篩選出5株能產生生物堿的菌株，利用薄層色譜技術進行生物堿的測定，5種株菌都產生了2個明顯的生物堿斑點。抑菌活性測定表明有2株菌對病原菌的抑制效果較為突出，抑菌直徑最高達11 mm。16S rRNA基因比對分析顯示，5株菌屬于鏈霉菌屬Streptomyces。篩選出的內生放線菌產生的生物堿與暗紫貝母均不相關，但其發酵液具有一定的抑菌效果，值得進一步研究。

[關鍵詞] 內生放線菌； 暗紫貝母； 抑菌活性； 生物堿

[Abstract] To explore the resource of endophytic actinomycete in Fritillaria unibracteata， and alleviate the shortage of F. unibracteata resource，using F.unibracteata as experimental materials which growth in the western Sichuan plateau and cut its healthy bulb.Pure culture， insert， TLC and Oxford cup were applied to observe the mycelial morphology， research the ability of producing alkaloid and its antibacterial activity. Totally， 14 endophytic actinomycete strains were isolated by using Gao culture media. Based on the color reaction， 5 typical strains were selected for producing alkaloid. Through the TLC technique， all strains produced 2 obvious alkaloids spots. Antibacterial activity determination showed that the antimicrobial effects of 2 strains is prominent， the diameter up to 11 mm.16S rRNA gene sequence comparison analysis showed that 5 strains belonging to the Streptomyces. The alkaloids produced by endophytic actinomycetes are not related to F. unibracteata， but its fermentation liquid has antibacterial effect， it is worthy of further study.

[Key words] endophytic actinomycete； Fritillaria unibracteata； antibacterial activity； alkaloids

川貝母為百合科Liliaceae，貝母屬Fritillaria L. 多種植物的干燥鱗莖，是常用中藥之一[1]。《中國藥典》歷版收載川貝母為百合科植物川貝母F. cirrhosa D. Don、暗紫貝母F. unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母F. przewalskii Maxim.、梭砂貝母F. delavayi Franch.的干燥鱗莖[2]。暗紫貝母作為川貝母的主要基原植物之一，是中國特有的中藥材，其干燥鱗莖作為著名的中藏藥材，能夠治療肺熱燥咳，咳痰帶血，干咳少痰，陰虛勞嗽等疾病，具有清熱潤肺，散結消腫，化痰止咳等功效[3]。由于貝母生境的惡化以及人為的大力采集，野生貝母資源面臨日益枯竭的嚴峻考驗[4]。為保護貝母野生資源，開發貝母內生菌資源并研究其次生代謝產物顯得尤為重要。經過多年的研究，已經從植物內生菌的發酵物中分離出大量的次生代謝產物，這些代謝物具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[5-7]。其中關于貝母內生菌的研究鮮有，趙帥等[8]從吉林省采集得到的平貝母樣品中分離得到內生菌，其中內生真菌9屬17種，內生細菌8屬15 種，并對其進行拮抗活性菌株篩選，得到5株具有較好拮抗活性的內生菌。葉波平等[9]從浙貝母的新鮮鱗莖分離得到貝母內生真菌Nectria sp.NO6，研究其活性代謝產物發現，發酵液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等病原菌具有明顯的抑制作用。但迄今為止，關于暗紫貝母內生放線菌的研究尚未見相關報道。

本次研究采集了川西高原小金巴郎山、四川省草科院紅原基地的野生暗紫貝母植株，通過選擇培養基和薄層色譜分析，希望分離篩選出產生物堿或新型活性生物堿的內生放線菌菌株，然后測定其抑菌活性。以此，開發暗紫貝母內生菌資源，豐富生物堿資源庫，并在一定水平上緩解暗紫貝母藥用局面的緊張，保護其野生資源。

1 材料

1.1 采樣點簡介

川西高原位于青藏高原東緣，地面海拔4 000～4 500 m，分為川西北高原和川西南山地兩部分。高原山地氣候，季節和晝夜溫差大，日照充足，具有利于野生貝母生長的良好氣候和生態環境。本次樣品采自川西高原小金巴郎山（102°54′1.27″E，30°56′16.33″N）、四川省草科院紅原基地（102°32′35.62″E，32°47′50.44″N）。endprint

1.2 供試植物

暗紫貝母F.unibracteata，鑒定人楊瑞武教授。

1.3 供試菌株

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus，白色念珠菌Candida albicans，大腸桿菌Escherichia coli，糞腸球菌Enterococcus faecalis，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa。

1.4 試劑

二氯甲烷，甲醇，SDS，硅膠G，異戊醇，氯仿，濃氨水，乙酸乙酯，亞硝酸鈉，均為分析純。硫酸鏈霉，氨芐青霉素鈉鹽。碘-碘化鉀試劑、碘化鉍鉀試劑、改良碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑，參照藥典配制[2]。

1.5 對照品

貝母素甲（HPLC≥98%），貝母辛（HPLC≥98%），西貝母堿（HPLC≥98%），貝母素乙（HPLC≥98%），均購自成都曼思特生物技術有限責任公司。

1.6 主要儀器

SJ-CJ-1F超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；SKP-02B電熱恒溫培養箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司；NSKY-100C恒溫培養振蕩器，上海蘇坤實業有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；JA3003電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；XS-PH50光學顯微鏡，深圳顯盛儀器有限公司。

1.7 培養基

改良高氏一號培養基：KNO3 1.0 g，FeSO4 0.01 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，可溶性淀粉20.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂 18.0 g，pH 7.2～7.4，蒸餾水1 000 mL，用于放線菌的分離[10]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 L，用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞桿菌的活化[11]。

沙氏培養基：蛋白胨 10.0 g，瓊脂 20.0 g，葡萄糖 40.0 g，蒸餾水 1 L，用于白色念珠菌的活化[12]。

2 方法

2.1 內生放線菌的分離[13-14]

取貝母的健康鱗莖，于45 ℃烘干得干燥鱗莖。按以下程序依次消毒：清水沖洗3～4次，75%乙醇漂洗30 s，無菌水漂洗3～4次，0.1%升汞消毒3～5 min，最后用無菌水沖洗3次。用無菌刀片將處理后的材料切成1 mm×5 mm×5 mm 的小塊貼于改良高氏一號培養基上，置28 ℃恒溫箱中培養4～7 d。取表面消毒最后一次沖洗的無菌水，涂布于培養基上，經培養若無微生物長出，表明表面消毒徹底，分離到的是內生菌 。待植物組織周圍長出菌后，挑少許菌絲到高氏一號培養基上純化4～6代，然后于4 ℃冰箱中保存菌種。

2.2 內生放線菌的生理生化鑒定[15]

對內生放線菌的碳源利用、明膠液化、硝酸鹽還原、纖維素水解、牛奶凝固和胨化、硫化氫的產生等方面進行考察。

2.3 產生物堿內生放線菌的初篩[16-18]

2.3.1 樣品液的制備 取菌種于高氏一號培養基活化5 d后，取直徑為4 mm的菌落接種到高氏一號培養液中（100 mL/250 mL），置于28 ℃恒溫搖床中130 r·min-1培養7 d。收集發酵液，60 ℃減壓濃縮至5 mL，加濃氨水調至pH 9～11，20 mL二氯甲烷萃取2～3次，收集油層，揮干，用0.5 mL乙醇定容，制得樣品液。

2.3.2 陽性樣品的制備 精確稱取對照品西貝素、貝母素甲、貝母素乙、貝母辛各1 mg，分別溶于1 mL乙醇中，為供試的對照品。取暗紫貝母粉末4 g，加濃氨水堿化1 h，10 mL二氯甲烷萃取2～3次，收集油層揮干，用0.5 mL乙醇定容，作為供試的陽性對照品。

2.3.3 初篩 取樣品制備液和陽性對照品，加酸調pH至酸性，分別滴加l～2滴以下試劑：碘-碘化鉀試劑；碘化鉍鉀試劑；改良碘化鉍鉀試劑；碘化汞鉀試劑，以陽性對照液為陽性對照，空培養基為陰性對照，觀察顏色變化。若產生桔黃色沉淀，為陽性反應；若產生青褐色渾濁，則為陰性反應。重復3次。

2.4 產生物堿的內生放線菌的復篩[19-20]

將初篩顯陽性的樣品制備液用于復篩。于105 ℃烘干30 min后活化的薄層色譜板（稱取適量硅膠G，加0.3% cMC-Na溶液，研磨鋪板，溫室干燥）上，用毛細吸管點取樣品制備液40 μL及陽性對照品15 μL，以稀碘化鉍鉀和0.5%亞硝酸鈉為顯色劑，乙酸乙酯-甲醇-濃氨水-水（18∶2∶1∶0.1）為展開劑。通過測定薄層色譜法中原點到斑點中心的距離與原點到溶劑前沿的距離的比值（Rf），從而判定發酵液中的生物堿是否與植株的生物堿成分相同。重復3次。

2.5 內生放線菌的鑒定

2.5.1 內生放線菌的形態學鑒定 將保存菌種于改良高氏一號培養基上活化，利用插片培養法，將滅菌蓋玻片以45°插入培養皿內的培養基中，然后用接種針將菌種接種在蓋玻片與瓊脂相接的沿線，放置28 ℃培養6～15 d，待菌絲剛好攀上蓋玻片，于顯微鏡下以0.1%美藍染色液染色，觀察放線菌菌絲特征，并記錄肉眼可觀察的放線菌菌落特征，如基內菌絲顏色、氣生菌絲顏色、菌落表面含水狀態、色素產生情況等。

2.5.2 內生放線菌DNA提取及16S rRNA基因測序 通過SDS法提取菌株的DNA[21]，成功提取代表菌株的DNA后，以引物8-27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1523-1504r（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[22]進行16S rRNA基因片段的擴增。PCR反應體系：模板<1 μg，引物各1 μL （10 μmol·L-1），10×Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 1 μL，Taq（5 U·μL-1） 0.5 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 10 min。endprint

對16S rRNA PCR基因的PCR擴增產物進行檢測，選用DL 2 000 Maker，用含EB1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳電壓為120 V，電泳時長為30 min，然后把瓊脂糖凝膠放在凝膠成像系統UV紫外燈下進行觀察，若1.5 kb的位置有條帶出現，則意味擴增成功，而后將擴増產物放于-20 ℃冰箱儲存備用。

2.6 內生放線菌生物堿的抑菌活性的測定

2.6.1 菌懸液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、糞腸球菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基，37 ℃活化24 h，白色念珠菌接種于沙氏培養基，35 ℃活化24 h，然后液體培養得到菌懸液。

2.6.2 抑菌藥液的制備 各取初篩呈陽性的300 mL菌株的發酵產物，60 ℃減壓濃縮至15 mL，加濃氨水調至pH 9～11，40 mL二氯甲烷萃取2～3次，收集油層，利用物質在堿性溶液中生成易溶物，在酸性溶液中生成沉淀的性質，用堿提取，酸沉淀原理，反復萃取達到提純分離目的，最后用乙酸乙酯定容至1.50 mL，制得藥液。以0.6 g·L-1氨芐青霉素鈉溶液和1 g·L-1硫酸鏈霉素溶液作陽性樣品。

2.6.3 抑菌活性的測定 [23] 每個平皿加入100 μL菌懸液，均勻涂布，通過牛津杯法，每皿內豎放4個牛津杯，每個牛津杯中加入200 μL內生放線菌的樣品制備液，以0.6 g·L-1氨芐青霉素鈉溶液及1 g·L-1硫酸鏈霉素溶液為陽性對照，以乙酸乙酯為陰性對照，重復4次。通過測定平板中透明圈的直徑，考察內生放線菌產生的生物堿對5種供試菌株的抑制作用。

3 結果與分析

3.1 內生放線菌的分離

從暗紫貝母健康鱗莖中總共分離得到14株內生放線菌，其中從采自小金巴郎山的暗紫貝母中分離得到9株內生放線菌，從采自四川省草科院紅原基地的暗紫貝母中分離得到5株內生放線菌。

3.2 內生放線菌的生理生化鑒定

參照放線菌生理生化鑒定方法對14株內生放線菌進行了鑒定，結果表明，14株放線菌均能以尿素和淀粉作為碳源，不能利用其他糖類（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、乳糖、半乳糖、甘露醇）；14株菌都具有還原硝酸鹽、水解纖維素的能力，且可能夠分解含硫的有機化合物產生硫化氫；菌株CS6和CS3牛奶凝固胨化實驗呈陽性，其余菌株均能使牛奶凝固；所有菌株中除了菌株CS6均能使明膠液化。

3.2 產生物堿內生放線菌的篩選

3.2.1 產生物堿內生放線菌的初篩 將14株內生放線菌的樣品液與碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑、改良碘化鉍鉀試劑反應，以空培養基為陰性對照，暗紫貝母提取液為陽性對照。通過觀察顏色變化，發現有5株菌株與試劑反應顯陽性，且經過3次重復，試驗結果重現性好。所以初步確定有5株菌株能產生生物堿，編號分別CS1，CS2，CS3，CS4，CS5。

3.2.2 產生物堿內生放線菌的復篩 借助薄層色譜技術，以乙酸乙酯-乙醇-濃氨水-水為展開劑，以稀碘化秘鉀和亞硝酸鈉為顯色劑，進行產生物堿菌株的復篩，測量生物堿的遷移率Rf。菌株CS1，CS2，CS3，CS4，CS5的樣品制備濃縮液均生成了明顯的生物堿斑點，5種菌株均產生2個生物堿斑點，CS1（Rf1=0.766，Rf 2=0.741），CS2（Rf 1=0.763，Rf 2=0.742），CS3（Rf 1=0.769，Rf 2=0.721），CS4（Rf 1=0.704，Rf 2=0.755），CS5（Rf 1=0.797，Rf 2=0.753）。但是，在本研究展開條件下，5株菌產生的生物堿斑點遷移率與陽性對照品（Rf 1=0.896，Rf 2=0.256，Rf 3=0.216，Rf 4=0.168）和對照品（貝母素甲Rf =0.778，貝母素乙Rf =0.878，貝母辛Rf =0.880，西貝母堿Rf =0.912）的遷移率并不相對應。CS1（Rf 1=0.766，Rf 2=0.741）與CS2（Rf 1=0.763，Rf 2=0.742）2個生物堿斑點Rf相似，其余菌株的Rf相差較大，但5株菌的生物堿斑點與暗紫貝母的主要生物堿斑點均不相關。

3.3 產生物堿內生放線菌的鑒定

3.3.1 內生放線菌形態學的鑒定 通過篩選，將5株能產生物堿的菌株分別接種改良高氏一號培養基上，利用插片法培養，待菌絲剛好攀上蓋玻片，觀察其菌落形態和菌絲形態（表1）。觀察發現，5株菌的菌落均為圓形，有皺褶，其表面干燥，菌落周圍有輻射狀放線菌絲。菌株菌絲粗細不，長短各異，生長緩慢，分枝多且孢子絲不易觀察。

3.3.2 內生放線菌系統發育分析 用SDS法提取菌株的DNA 并進行聚合酶鏈式反應，測序結果顯示片段長度約為1 500 bp，通過Blast比對分析，按照匹配度最高的原則，鑒定菌株系統發育特征。比對分析結果顯示（表2），5株菌均為鏈霉菌屬Streptomyces，CS1與Streptomyces sp.DST13（KM405298）相似性為100%，CS2與S.coelicoflavus strain RA10（KJ995819）相似性為100%，CS3與Streptomyces sp.VAI-7（KM220610）相似性為100%，其余菌株與匹配菌株的相似度均為99%。

利用ClustalX軟件進行多序列比對，用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。系統發育分析結果（圖1）表明，5株菌均為革蘭陽性菌，其中菌株CS3與CS4的親緣關系較近，這與放線菌的菌落特征和菌絲形態觀察結果相對應。

3.4 產生物堿內生放線菌抑菌活性的測定

通過牛津杯法測定菌株發酵液的抑菌活性（表3）結果表明，5株菌中CS4菌株和CS5菌株的抑菌效果最突出，CS4能夠抑制4種病原菌的生長，對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌直徑均為10.07 mm，抑制效果中等（10 mm<抑菌圈直徑<15 mm）；CS5對大腸桿菌抑制作用最好，抑菌直徑達到11 mm（10 mm<抑菌圈直徑<15 mm），同時對金黃色葡萄球菌有抑制作用，抑制效果中等（10 mm<抑菌圈直左下端標尺表示堿基置換頻率。endprint

4 討論

暗紫貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia為百合科貝母屬植物，是中藥“川貝母”的重要來源之一。近年來，暗紫貝母的市場需求逐漸增加，但由于藥用暗紫貝母主要來源于野外，野生的暗紫貝母被過度采挖后野生資源數量逐漸下降[24-25] 。基于此，本文依據現有的關于川貝母的研究文獻，借鑒其他的“川貝母”研究結果，以高原野生藥材暗紫貝母為研究對象，希望從中分離出產貝母類生物堿或新型活性生物堿的內生放線菌，從而在一定程度上緩解暗紫貝母藥用資源短缺的現狀，同是借內生放線菌產生的新型化合物以填充天然藥用的資源庫。

李明哲[26]以平貝母為實驗材料分離得到10株內生真菌，對其發酵產物運用薄層色譜方法進行篩選，結果篩選出1株能產生貝母類生物堿的高產菌。研究其發酵液及菌絲體抗腫瘤、抗單胺氧化酶以及抗乙酰膽堿酯酶活性，發現該菌株具有一定的抗人宮頸癌細胞HeLa細胞的活性。高俊杰等[27]以浙貝母為實驗材料，采用組織分離印跡對照法得到36種內生真菌。以牛津杯法檢測菌株的抑菌活性，然后對活性菌株進行發酵培養，發現菌株BJ7抑菌活性較高，其抑菌活性物質極性較大且熱不穩定，具有產生生物堿的能力。本次研究從暗紫貝母中分離篩選出5株產生物堿的內生放線菌，并采用牛津杯法進行抑菌活性的測定。結合薄層色譜分析和抑菌測定結果得出，暗紫貝母內生放線菌所產生的生物堿種類和與其活性有一定的共性，這與前人的研究成果相似。鏈霉菌屬微生物可合成生物堿、蒽醌、黃酮等結構多樣的次生代謝產物，同時，這些代謝物質還具備拮抗微生物、抗腫瘤、酶抑制等多種生物活性[28]。本研究篩選得到的5株鏈霉菌中有2株菌的抑菌效果較為突出，CS4菌株能夠抑制4種病原菌的生長，對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的生長有較好的抑制效果；CS5菌株對大腸桿菌的抑菌直徑達11 mm，且能抑制金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的生長。

綜上，本文對川西高原暗紫貝母進行了產生物堿內生放線菌的篩選、鑒定及抑菌活性的測定。篩選菌株均分屬于鏈霉菌屬Streptomyces，能產生生物堿類活性物質，且具有一定的抑菌活性，為開發天然的新藥提供了更豐富的資源，表現出潛在的應用價值。

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[責任編輯 呂冬梅]endprint