人工打洞沉香中1個新的倍半萜

鄺彤東+陳惠琴+李薇+楊錦玲+周麗曼+蔡彩虹+董文化+梅文莉+戴好富

[摘要] 運用多種色譜技術，對人工打洞沉香乙醇提取物的正丁醇相進行化學成分分離，并根據波譜數據結合理化性質共鑒定了7個單體化合物的結構，分別為selina-3，11-dien-9，15-diol （1）、aquilarone D （2）、5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy- 2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）、6，7-dimethoxy-2- [2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）、syringin （5）、順式對羥基肉桂酸甲酯 （6）和4′-甲氧基肉桂酸 （7），其中化合物1為新的倍半萜類化合物，化合物5～7為首次從沉香中分離得到。生物活性測試結果表明化合物6，7對全齒復活線蟲具有較好的致死活性，化合物4，6，7對人肝癌細胞株BEL-7402、人胃癌細胞株SGC-7901和人肺癌細胞株A549的生長有不同程度的抑制作用。

[關鍵詞] 沉香； 正丁醇相； 倍半萜； 生物活性

[Abstract] In order to study the chemical constituents of n-butanol fraction of ethanol extract from Chinese agarwood induced by artificial holing， various chromatographic techniques were carried out to isolate compounds， and the structures of compounds were determined through a combined analysis of physicochemical properties and spectroscopic evidence. Seven compounds were obtained and identified as selina-3，11-dien-9，15-diol （1）， aquilarone D （2）， 5α，6β，7α，8β-tetrahydroxy-2-[2-（2-hydroxyphenyl）ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone （3）， 6，7-dimethoxy-2-[2-（4-methoxyphenyl）ethyl]chromone （4）， syringin （5）， methyl （Z）-p-coumarate （6）， and 4′-methoxycinnamic acid （7）， among which compound 1 was a new compound and compounds 5-7 were isolated from agarwood for the first time. The bioactivity assay results concluded that compounds 6 and 7 showed certain nematicidal activity against Panagrellus redivivus， and compounds 4， 6 and 7 exhibited cytotoxicity against BEL-7402， SGC-7901 and A549 carcinoma cell lines.

[Key words] agarwood； n-butanol extract； sesquiterpene； biological activity

沉香為瑞香科Thymelaeceae沉香屬Aquilaria或擬沉香屬Gyrinops植物受傷后產生的含樹脂的干燥芯材[1]。白木香A. sinensis （Lour.）Gilg為我國特有的沉香基原植物，主要生長于海南、福建、廣東、廣西等地區[2]。沉香入藥已有兩千多年歷史，其味辛、苦，性微溫，具有降氣溫中，暖腎納氣的功效[3-4]。現代藥理研究表明，沉香在抗腫瘤、降血脂、抗菌消炎、鎮靜安神等[5-9]方面具有一定的作用。據文獻報道，沉香的特征性化學成分為多種骨架類型的倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮類化合物[10]，目前相關研究主要集中于野生沉香，而針對人工沉香的研究相對缺乏。隨著野生沉香資源變得日益匱乏，人工沉香能否代替野生沉香的問題變得尤為重要，所以本課題對人工沉香重要來源之一的人工打洞沉香進行深入研究。

本研究組前期從國產人工打洞沉香的乙酸乙酯相分離鑒定了一系列結構新穎并具有一定生物活性的化合物[11-12]。在此基礎上，本研究首次針對國產人工打洞沉香的正丁醇相進行化學成分研究，從中分離鑒定了7個單體化合物（圖1），其中化合物1為新的倍半萜類化合物。結合人工打洞沉香乙酸乙酯相與正丁醇相分離得到的化合物，可以為更好地評價人工打洞沉香的品質提供理論基礎。

1 材料

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；戴安SUMMITP680A半制備高效液相色譜儀（美國戴安公司）；HR-ESI-MS質譜儀（瑞士布魯克公司）；ESI-MS質譜儀（瑞士布魯克公司）；布魯克AV-500核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；ELX-800酶標儀（美國寶特公司）；薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（德國默克公司）；D101型大孔吸附樹脂（山東魯抗醫藥股份有限公司）；N-1000（2L）立式旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；超純水裝置（廈門銳思捷水純化技術有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；1/1萬電子秤（北京賽多利斯天平有限公司）；濃硫酸（淄博濱嶺化工有限公司）；核磁共振用氘代試劑（德國默克公司）；常用AR級試劑購買自廣州化工和天津大茂等公司；色譜純試劑購買于天津四友和天津康科德等公司；紫杉醇購于江蘇紅豆杉藥業有限公司；人肝癌細胞株BEL-7402、人胃癌細胞株SGC-7901和人肺癌細胞株A549均購于中山大學實驗動物中心細胞庫。endprint

結香4年人工打洞沉香（4.7 kg）于2012年11月采自云南省西雙版納傣族自治州，經中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所代正福副研究員鑒定其基源植物為白木香A. sinensis，樣本保存在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所（標本編號AW20121108）。

2 提取與分離

人工打洞沉香樣品（4.7 kg）粉碎后用95%乙醇（15.0 L）回流提取3次，減壓濃縮得到浸膏（510.0 g）。隨后將浸膏分散至水中，用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次。濃縮后將正丁醇相浸膏（199.0 g）經大孔吸附樹脂D101吸附后用甲醇洗脫濃縮得浸膏92.0 g，再將該浸膏經減壓硅膠柱色譜進行分離，以氯仿-甲醇系統（1∶0～0∶1）梯度洗脫，濃縮后經TLC薄層色譜檢測，合并顯色劑顯色和Rf相同的部分，得10個流分（Fr.1～10）。Fr. 2（氯仿-甲醇80∶1洗脫流分，2.5 g）先經RP-18柱色譜以甲醇-水（2∶3～1∶0）為流動相進行梯度洗脫，得到9個流分（Fr.2.1～2.9）。Fr.2.3（甲醇-水2∶3洗脫流分，189.0 mg）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以甲醇為流動相進行洗脫得3個流分（Fr.2.3.1～2.3.3）。Fr.2.3.2（87.8 mg）再經硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯系統（100∶1，20∶1，10∶1，3∶1）為流動相洗脫得4個流分（Fr.2.3.2.1～2.3.2.4）。Fr.2.3.2.2（石油醚-乙酸乙酯100∶1洗脫流分，16.2 mg）再經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以石油醚-氯仿-甲醇（2∶1∶1）系統為流動相洗脫得2個流分（Fr.2.3.2.2.1～2.3.2.2.2）。Fr.2.3.2.2.2（10.2 mg）經半制備型HPLC（C18柱；45%甲醇-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物6（3.0 mg）和7（3.6 mg）。Fr.2.4（甲醇-水1∶1洗脫流分，53.0 mg）經半制備HPLC（C18柱；30%乙腈-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物1（1.5 mg）。Fr.2.6（甲醇-水3∶2洗脫流分，585.0 mg）有白色固體析出，用甲醇重結晶后其母液部分濃縮得471.1 mg，經Sephadex LH-20凝膠柱色譜以甲醇為流動相洗脫得4個流分（Fr.2.6.1～2.6.4）。Fr.2.6.2（118.0 mg）經半制備HPLC（C18柱；45%甲醇-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物4（4.7 mg）。

Fr.8（氯仿-甲醇5∶1洗脫流分，14.9 g）首先經Sephadex LH-20凝膠柱色譜以甲醇作為流動相除去色素，剩余樣品（11.9 g）經RP-18柱色譜以甲醇-水（2∶3～1∶0）系統為流動相進行梯度洗脫，得9個流分（Fr.8.1～8.9）。Fr.8.1（甲醇-水2∶3洗脫流分，441.5 mg）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以甲醇為流動相洗脫得4個流分（Fr.8.1.1～8.1.4）。Fr.8.1.2（21.3 mg）經硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯系統（1∶10）洗脫得3個流分（Fr.8.1.2.1～8.1.2.3）。Fr.8.1.2.2（石油醚-乙酸乙酯1∶10洗脫流分，4.6 mg）經過半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物5（3.4 mg）。Fr.8.1.4（164.8 mg）經硅膠柱色譜以氯仿-甲醇系統（30∶1，25∶1，10∶1）為流動相洗脫得4個流分（Fr.8.1.4.1～8.1.4.4）。Fr.8.1.4.2（氯仿-甲醇25∶1洗脫流分，12.9 mg）經半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物2（2.8 mg）。Fr.8.2（甲醇-水2∶3洗脫流分，6.3 g）取部分樣品（135.0 mg），直接經半制備HPLC（C18柱；30%甲醇-水系統為流動相；流速4 mL·min-1；檢測波長254 nm）分離得化合物3（2.2 mg）。

3 結構鑒定

化合物1 黃色油狀物（CHCl3）；HR-ESI-MS m/z 259.166 6[M+Na]+（計算值為259.166 9），結合1H-NMR和13C-NMR 數據，確定其分子式為C15H24O2，不飽和度為4。化合物的1H-NMR（CDCl3，500 MHz）譜中呈現2個甲基單峰信號δH 1.76（3H，s）和0.80（3H，s），3個烯氫信號δH 4.73（1H，br s），4.74（1H，br s）和5.67（1H，s），3個連氧碳上的氫信號δH 3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz），3.98（1H，d，J=12.3 Hz）和4.12（1H，d，J=12.5 Hz）。化合物的13C-NMR（DEPT）譜中顯示有15個碳信號，其中包含4個雙鍵碳信號，其余的碳信號中含有2個甲基碳（δC 20.9和10.1），5個亞甲基碳（δC 22.4，27.5，32.8，35.1，65.9）包含1個連氧碳，3個次甲基碳（δC42.9，43.6，78.0）包含1個連氧碳，1個季碳（δC37.6）。通過上述分析，并與文獻[13]中的化合物（5S，7S，9S，10S）-（+）-selina-3，11-dien-9-ol對比，發現兩者差別僅在于已知化合物的14位甲基被氧化為羥甲基，即已知化合物的14位信號[δH 1.63（3H，s）； δC 21.7]被化合物1中的信號[δH 4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b）； δC 65.9]所取代，所以該化合物也推斷為桉烷型骨架的倍半萜。另外根據二維波譜數據（圖2），在HMBC譜中，H2-14與C-3，C-4，C-5有相關，進一步證明了14位羥甲基的存在；H-12與C-7，C-11，C-13有相關，H-13與C-7，C-11，C-12有相關，表明異丙烯基的存在，并連接在C-7位上。再結合HSQC和1H-1H COSY相關譜推導出化合物1的結構見圖2。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ： 5.67（1H，s，H-3），4.74（1H，br s，H-12a），4.73（1H，br s，H-12b），4.12（1H，d，J=12.5 Hz，H-14a），3.98（1H，d，J=12.3 Hz，H-14b），3.40（1H，dd，J=11.4，4.5 Hz，H-9），2.07-2.11（4H，m，H-2a，2b，5，7），1.93～1.96（1H，m，H-1a），1.85（2H，m，H-6a，8a），1.76（3H，s，H-13），1.58（1H，J=11.7 Hz，H-8b），1.25（1H，m，H-1b），1.21（1H，m，H-6b），0.80（3H，s，H-15）； 13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ： 32.8（C-1），22.4（C-2），124.3（C-3），137.4（C-4），43.6（C-5），27.5（C-6），42.9（C-7），35.1（C-8），78.0（C-9），37.6（C-10），149.2（C-11），109.2（C-12），20.9（C-13），65.9（C-14），10.1（C-15）。綜上所述，化合物1的結構鑒定為selina-3，11-dien-9，15-diol，經查閱文獻，該化合物為新化合物。endprint

4 生物活性測試

采用貝曼漏斗法[20]和MTT法[21]分別測定了化合物1～7全齒復活線蟲致死活性和細胞毒活性（表3）。

5 結果與討論

本研究組前期對人工打洞沉香的乙酸乙酯相進行化學成分研究，從中分離鑒定了76個化合物，其中18個倍半萜類化合物，50個2-（2-苯乙基）色酮類化合物和8個其他類化合物[11-12]。在此基礎上，本研究通過多種柱色譜技術首次對人工打洞沉香正丁醇萃取相的化學成分進行研究，分離得到7個化 合物，其中1個新倍半萜類化合物（1），3個2-（2-苯乙基）色酮類化合物（2～4），3個苯丙素類化合物（5～7），其中化合物5～7為首次從沉香中分離得到。生物活性測試結果顯示化合物6和7對全齒復活線蟲具有較好的致死活性，化合物4和6分別對人肝癌細胞BEL-7402、人胃癌細胞SGC-7901和人肺癌細胞A549的生長均有一定的抑制作用，化合物7對人胃癌細胞株SGC-7901的生長有較弱的抑制活性。研究結果為沉香的進一步開發利用提供了科學依據。

[參考文獻]

[1] Liu Y Y， Wei J H， Gao Z H， et al. A review of quality assessment and grading for agarwood [J]. Chin Herb Med， 2017， 9（1）： 22.

[2] 楊林， 喬立瑞， 謝丹， 等. 國產沉香中的倍半萜類和單萜類化學成分 [J]. 中國中藥雜志， 2012， 37（13）： 1973.

[3] 梅全喜，吳惠妮，梁食，等. 中山沉香資源調查與開發利用建議[J]. 今日藥學，2011，21（8）：487.

[4] 中國藥典.一部 [S]. 2010： 172.

[5] Hashim Y Z H Y， Phirdaous A， Azura A. Screening of anticancer activity from agarwood essential oil [J]. Pharmacognosy Res， 2014， 6（3）： 191.

[6] 周富強， 田素英， 潘建龍， 等. 樟樹莖與沉香醇提取物藥理作用對比研究 [J]. 中醫學報， 2013， 28（12）： 1849.

[7] Yadav D K， Mudgal V， Agrawal J， et al. Molecular docking and ADME studies of natural compounds of agarwood oil for topical anti-inflammatory activity [J]. Curr Comput Aided Drug Des， 2013， 9（3）： 360.

[8] Chen H Q， Yang Y， Xue J， et al. Comparison of compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood， wild agarwood and healthy Aquilaria sinensis （Lour.）Gilgtrees [J]. Molecules， 2011， 16（6）： 4884.

[9] Miyoshi T， Ito M， Kitayama T， et al. Sedative effects of inhaled benzylacetone and structural features contributing to its activity [J]. Biol Pharm Bull， 2013， 36（9）： 1474.

[10] Naef R. The volatile and semi-volatile constituents of agarwood， the infected heartwood of Aquilaria species： a review [J]. Flavour Frag J， 2011， 26（2）： 73.

[11] 李薇. 白木香與人工打洞沉香的化學成分與生物活性研究 [D]. 海口：海南大學， 2014.

[12] 廖格. 人工沉香中2-（2-苯乙基）色酮類化合物的分離鑒定與動態變化規律 [D]. 海口： 海南大學， 2015.

[13] Ishihara M， Tsuneya T， Shiga M， et al. Three sesquiterpenes from agarwood [J]. Phytochemistry， 1991， 30（2）： 563.

[14] Chen D， Xu Z R， Chai X Y， et al. Nine 2-（2-phenylethyl）chromone derivatives from the resinous wood of Aquilaria sinensis and their inhibition of LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells [J]. Eur J Org Chem， 2012，（27）： 5389.

[15] Shimada Y， Konishi T， Kiyosawa S. Studies on the agalwood（Jinko）. VI. Structures of three 2-（2-phenylethyl）-5，6，7，8-tetrahydrochromone derivatives， AH1A， AH2a and AH2b [J]. Chem Pharm Bull， 1986， 34（7）： 3033.

[16] Iwagoe K， Konishi T， Kiyosawa S， et al. Studies on the agalwood（Jinko）. Ⅶ. Structures of phenylethylchromone derivatives AH7， AH8， and AH9[J]. Chem Pharm Bull， 1988， 36（7）： 2417.

[17] Fukunaga T， Kajikawa I， Nishiya K， et al. Studies on the constituents of the Japanese mistletoe， Viscum album L. var. coloratum Ohwi grown on different host trees [J]. Chem Pharm Bull， 1989， 37（5）： 1300.

[18] Jung Y J， Park J H， Seo K H， et al. Phenolic compounds from the stems of Zea mays and their pharmacological activity [J]. J Korean Soc Appl Biol Chem， 2014， 57（3）： 379.

[19] 沈嵐， 蔣思萍， 朱華結. 藏波羅花化學成分的研究 [J]. 天然產物研究與開發， 2012， 24（9）： 1210.

[20] 馬青云， 黃圣卓， 李紅芳， 等. 杠板歸中化學成分生防活性研究 [J]. 湖北農業科學， 2013， 52（21）： 5245.

[21] Ellman G L， Courtney K D， Andres V， et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochem Pharmacol， 1961， 7（2）： 88.

[責任編輯 丁廣治]endprint