竹節參總皂苷通過調節AMPK/Sirt1/NF—κB通路抑制衰老大鼠心肌細胞凋亡的作用研究

宋亞男+袁丁+張長城+王烙佩+何毓敏+王婷+周志勇

[摘要] 研究竹節參總皂苷（saponins extracted from Panax japonicus，SPJ）對自然衰老大鼠心肌細胞凋亡的調節作用及其作用機制。將SD雄性大鼠隨機分為青年對照組、自然衰老組、SPJ低劑量組、SPJ高劑量組，每組10只。自然衰老組、SPJ低、高劑量組從18月齡開始分別灌胃給予生理鹽水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1，每周灌胃6 d，持續6個月至24月齡處理動物。HE染色觀察各組大鼠心肌形態；Tunel法檢測心肌細胞凋亡；Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Bcl-2，Bax，IL-1β，TNF-α，AMPK，p-AMPK，Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表達。SPJ能有效改善自然衰老大鼠心肌纖維的排列紊亂，減少炎性細胞浸潤，抑制心肌細胞凋亡。同時，SPJ能明顯抑制自然衰老過程中心臟組織Bax，IL-1β，TNF-α，Ac-NF-κB p65的表達，促進Bcl-2，Bcl-2/Bax，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白表達。SPJ可有效抑制自然衰老大鼠心肌細胞凋亡，其作用機制可能與調節AMPK/Sirt1/NF-κB通路介導的炎癥反應有關。

[關鍵詞] 竹節參總皂苷； 自然衰老大鼠； 心肌細胞凋亡； 炎癥反應； AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路

[Abstract] To investigate the effects of saponins extracted from Panax japonicus（SPJ） on cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats and explore its underlying mechanisms. SD male rats were randomly divided into four groups： young control group， natural aging group， SPJ low dose group and SPJ high dose group， with 10 rats in each group. The rats in natural aging group， SPJ low and high dose groups were respectively treated with normal saline， SPJ 10 and 60 mg·kg-1·d-1 from the beginning of 18 month-old， 6 days per week for 6 months till 24 month-old. Then the animals were sacrificed. Their myocardial morphology changes were observed by using haematoxylin-eoin（HE） staining； cardiomyocyte apoptosis was tested by using Tunel assays； and the protein expression levels of Bcl-2， Bax， IL-1β， TNF-α， AMPK， p-AMPK， Sirt1， and Ac-NF-κB p65 in myocardial tissues of rats were detected by Western blot. The results showed that SPJ could effectively improve the arrangement disorder of myocardial fibers， reduce the infiltration of inflammatory cells and inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats. At the same time， SPJ could significantly inhibit the protein expression of Bax， IL-1β， TNF-α and Ac-NF-κB p65， and increase the expression of Bcl-2， Bcl-2/Bax， p-AMPK/AMPK and Sirt1 in the heart tissues of natural aging rats. SPJ can effectively inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats， and its mechanisms may be related with the regulation of inflammatory reaction by AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway.

[Key words] saponins extracted from Panax japonicus； natural aging rats； cardiomyocyte apoptosis； inflammatory response； AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway

隨著我國人口老齡化的不斷推進，心血管疾病的發病、死亡率逐年上升。衰老是導致心血管疾病發生、發展的重要危險因素[1]，在正常衰老過程中，心肌細胞凋亡數量顯著增多[2]，心臟表現出慢性低度炎性狀態[3]；隨著衰老的加劇心肌細胞凋亡和炎癥反應不斷增加，最終導致心臟重構和心功能衰退。竹節參系五加科人參屬植物竹節參Panax japonicus的干燥根莖，是我國西南地區民間常用中草藥，竹節參總皂苷（saponins extracted from P.japonicus，SPJ）為其主要活性成分。研究表明SPJ能抑制H9c2大鼠心肌細胞中促凋亡蛋白Bax的活性，降低Caspase-3的表達，促進抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌細胞凋亡[4]；同時能降低心肌梗死大鼠血清中MCP-1，TNF-α水平，抑制心肌細胞炎癥反應，改善心臟功能[5]。但SPJ對自然衰老大鼠心臟組織的保護作用尚未見報道。本研究將利用自然衰老大鼠模型，從心肌細胞凋亡和心肌炎癥方面探討SPJ對自然衰老大鼠心臟組織的保護作用及其機制，為臨床應用提供理論基礎和實驗依據。endprint

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，18月齡30只，6月齡10只，均購自三峽大學實驗動物中心，實驗單位使用許可證號SYXK（鄂）2011-0061，許可證號SCXK（鄂）2011-0012。

1.2 儀器 IX53顯微鏡（日本Olympus公司）；LEICA EG 1150H石蠟包埋機、LEICA TP 1020自動脫水機、LEICA EG 1150C超薄切片機（德國Leica公司）；PowerPacTMBasic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；BioshineChemiQ 4800化學發光凝膠成像自動顯影儀（中國上海歐翔科學儀器有限公司）。

1.3 藥物與試劑 竹節參的塊根采集于湖北恩施椿木營竹節參種植基地，由日本國立富山大學博士，現就任三峽大學醫學院講師何毓敏鑒定為五加科人參屬植物竹節參P.japonicus的干燥根莖。SPJ的提取方法見本課題組前期工作，提取率為18.4%，純度83.48%[6]。蘇木精（G1004）、伊紅（G1001）、PMSF（G2008）、磷酸蛋白酶抑制劑（G2007）、ECL顯影液（G2014）均購自武漢谷歌生物科技有限公司；RIPA裂解液（C1053）、BCA蛋白濃度定量試劑盒（P1511）均購自北京普利萊基因技術有限公司。Tunel-細胞凋亡原位檢測試劑盒（德國Roche公司，10768100）。AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-25792）；p-AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-33524）；TNF-α（Santa Cruze，sc-1350）；Ac-NF-κB p65（Abcam，ab19870）；IL-1β（Abcam，ab9722）；Bcl-2（Abcam，ab59348）；Bax（Abcam，ab182733）；Sirt1（Millpore，07-131）；GAPDH（Cell Signaling，5174）。辣根過氧化酶標記的山羊抗兔（125510）、山羊抗小鼠（125435）、兔抗山羊（111004）均購自武漢科瑞生物技術有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 將30只18月齡SD雄性大鼠隨機分為自然衰老組、SPJ低劑量組、SPJ高劑量組，每組10只，從18月齡開始分別灌胃給予生理鹽水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1；每周灌胃6 d；持續6個月至24月齡處理動物；另取10只6月齡大鼠做青年對照組。

2.2 HE染色觀察SPJ對衰老大鼠心肌組織形態變化的影響 大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦5～7 mL·kg-1麻醉后，快速取出心臟組織，組織塊經4%中性多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，常規石蠟包埋，制作切片其厚度為4 μm。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯入水后，蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，再經乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察心肌組織的形態變化。

2.3 Tunel試劑盒檢測SPJ對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響 石蠟切片經常規脫蠟脫苯入水處理后，按照Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒的操作步驟染色，光鏡觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞核呈棕褐色。于400倍的光鏡下每張切片隨機選擇2～3個視野，計算每個視野中凋亡細胞核數和總細胞核數，計算心肌細胞凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

2.4 Western blot檢測SPJ對衰老大鼠心肌組織蛋白表達的影響 稱取約50 mg的心臟組織，加入700 μL裂解液（按RIPA裂解液-PMSF-磷酸蛋白酶抑制劑A，B液=100∶1∶1配制）研磨、離心，提取得到總蛋白。BCA法蛋白定量，加入2×的上樣緩沖液煮沸變性10～15 min，SDS-PAGE 凝膠電泳并轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次（5 min/次），二抗室溫孵育1 h后，TBST洗3次（5 min/次），加入ECL顯影液顯色。化學發光凝膠成像系統下顯影成像，ImageJ1.42q軟件對目的條帶進行灰度掃描，目的蛋白表達水平以其與內參GAPDH 灰度比值來表示。

2.5 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學處理，Western blot結果采用ImageJ1.42q軟件進行分析，數據以±s表示，用單因素方差分析檢驗各組間差異的顯著性，P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 SPJ對衰老大鼠心肌組織形態變化的影響 HE結果顯示，6月齡大鼠心肌纖維排列整齊，結構清晰、緊湊，未見炎性細胞浸潤；與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠心肌纖維排列紊亂、疏松，細胞間隙增大，同時出現大量炎性細胞浸潤。SPJ低、高劑量能明顯改善衰老大鼠心臟組織的肌纖維形態及其病理性變化，見圖1。

3.2 SPJ對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響 Tunel法的原理是細胞凋亡過程中基因組DNA發生斷裂，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）可催化標記這些DNA鏈斷裂和缺口處的3′-OH末端，進行后續識別，將正常細胞核染成藍色，凋亡陽性細胞核染成棕褐色。結果顯示，6月齡大鼠僅見個別凋亡細胞，24月齡大鼠細胞凋亡數顯著增加；而SPJ干預后心肌細胞凋亡數量明顯減少，見圖2。統計結果表明，與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠的心肌凋亡指數顯著升高（P<0.01）；與24月齡大鼠比較，SPJ低、高劑量組大鼠的凋亡指數明顯降低（P<0.01）。

3.3 SPJ對衰老大鼠心肌凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax表達水平的影響 與6月齡大鼠相比，24月齡大鼠心臟組織中Bcl-2蛋白含量顯著下降（P<0.01），Bax蛋白表達量上升（P<0.05），且Bcl-2/Bax明顯降低（P<0.05）。而給予低、高劑量的SPJ后，與24月齡大鼠相比較，Bcl-2蛋白表達量和Bcl-2/Bax均有所上升，尤其是SPJ高劑量組大鼠更加明顯（P<0.01）；Bax蛋白表達呈下降趨勢，且SPJ高劑量大鼠顯著降低（P<0.01），見圖3。endprint

3.4 SPJ對衰老大鼠心肌組織中炎性因子IL-1β，TNF-α的影響 與6月齡大鼠相比，24月齡大鼠心臟中炎性因子IL-1β，TNF-α的表達水平顯著上調（P<0.05）。給予低、高劑量的SPJ干預后，與24月齡大鼠相比，IL-1β，TNF-α的蛋白含量均有所下降，且以SPJ高劑量組效果最佳（P<0.01）；此外，SPJ低劑量組的炎癥因子TNF-α表達也顯著降低（P<0.05），見圖4。

3.5 SPJ對衰老大鼠心肌組織中AMPK活化、Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表達的影響 與6月齡大鼠比較，24月齡大鼠心肌組織中AMPK活化，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白水平明顯下調、Ac-NF-κB p65蛋白表達上調。給予低、高劑量的SPJ與24月齡大鼠相比較，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白的表達顯著升高，而Ac-NF-κB p65蛋白的表達顯著下降，并具有明顯的統計學差異，見圖5。

4 討論

中醫學認為心為五臟六腑之大主，主血脈；氣乃構成和維持人體生命活動的物質基礎。心氣可推動、調節血液在脈管中的運動并流注全身，發揮營養和滋潤的作用。年老體虛者中氣不足，“心氣虧虛，無力溫運血脈，血行不暢，停而為瘀”[7]。《中國藥典》2015年版指出：竹節參具散瘀止血、消腫止痛、滋補強壯之功效，主要用于跌撲損傷、病后虛弱等癥狀[8]。現代藥理學研究表明機體衰老過程中心臟僵硬度增加、順應性降低、舒縮功能障礙，并伴隨著 心肌細胞凋亡增加，心肌炎性反應加劇，最終導致心臟重構和心功能衰退，進一步誘發多種繼發病[9-10]；而竹節參的主要成分竹節參總皂苷具有抗炎[11]、抗腫瘤[12]等多種藥理活性，對心血管系統具有良好的藥理作用。

基于此，本實驗將以自然衰老大鼠為模型，研究竹節參總皂苷對心肌細胞凋亡的保護作用及其作用機制。HE結果顯示，SPJ可明顯改善大鼠衰老進程中所伴隨的心肌纖維疏松、紊亂，心肌細胞腫脹、間隙增大以及大量的炎性細胞浸潤等病理現象，表明SPJ對自然衰老大鼠的心臟組織具有良好的保護作用。

心肌細胞凋亡是心臟衰老的重要特征，有研究指出，在D-半乳糖誘導的衰老大鼠模型中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達上升，促凋亡蛋白Bax表達下降，心肌細胞凋亡明顯增加[13]。Tunel和Western blot結果顯示：SPJ能有效干預大鼠在自然衰老過程中所表現的心肌細胞凋亡數、細胞凋亡指數顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達水平上調，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達以及Bcl-2/Bax顯著下降。說明SPJ能顯著抑制自然衰老大鼠的心肌細胞凋亡。

炎癥反應是心臟衰老的主要特征，衰老可促使心肌炎癥反應增強，導致心功能受損[14]；激活炎性因子如TNF-α，IL-1β能誘導心肌細胞凋亡，促使心肌細胞減少、心臟組織功能障礙[15] 。本課題組前期工作證明，SPJ能顯著抑制脂多糖刺激下RAW264.7巨噬細胞所分泌的炎性因子TNF-α，IL-1β，從而達到抗炎目的[11]。本實驗結果也顯示，SPJ能有效抑制自然衰老大鼠心臟組織中炎性因子TNF-α，IL-1β的表達，抑制炎癥反應。說明大鼠心臟組織在衰老過程中炎癥反應增加，其分泌的大量炎性因子是誘導心肌細胞凋亡的重要因素；而SPJ能顯著抑制炎癥反應及其誘導的心肌細胞凋亡，從而保護衰老大鼠心臟組織。基于此，本實驗將進一步深入探討SPJ對抗衰老大鼠炎性反應的作用機制。

NF-κB是調節炎癥反應的關鍵蛋白；生理條件下，胞漿中NF-κB與抑制蛋白IκB結合處于失活狀態；當細胞受到刺激時，NF-κB活化，其主要亞基NF-κB p65與IκB解離并轉移到胞核激活轉錄，調控下游多種炎癥相關因子，促進炎癥反應[16]。有研究表明，沉默信息調節因子1 （silent information regulator 1，Sirt1）可將NF-κB p65去乙酰化阻止NF-κB p65信號通路活化，降低多種促炎細胞因子的表達[17-18]。而激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acti-vatedprotein kinase，AMPK）可上調巨噬細胞中Sirt1 的表達水平，降低NF-κB乙酰化和促炎因子的表達；并進一步指出，AMPK對NF-κB的抑制作用需要Sirt1的參與[19-20]。同時，本實驗結果顯示，SPJ能有效促進衰老大鼠心臟中AMPK活化及Sirt1蛋白表達，抑制Ac-NF-κB p65蛋白表達。由此說明SPJ抑制自然衰老大鼠炎癥反應的作用機制與AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路有關。

綜上所述，SPJ對自然衰老大鼠心臟組織具有良好的保護作用。其機制可能是SPJ通過促進衰老大鼠心臟組織中AMPK蛋白磷酸化，上調Sirt1蛋白表達水平，抑制NF-κB p65乙酰化，下調其下游相關炎性因子的表達，從而抑制炎癥反應，降低心肌細胞凋亡。故推測，SPJ抑制自然衰老大鼠心肌細胞凋亡的作用機制可能與AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路介導的炎癥反應有關。

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[責任編輯 張寧寧]endprint