洋金花提取物對單胺氧化酶B的抑制作用研究

李冰+宮彬彬+王亮亮

【摘要】 目的 研究洋金花對單胺氧化酶B（MAO-B）的抑制效果及抑制類型。方法 采用醇提水沉法對洋金花不同部位進行提取， 獲得提取物， 并計算得率。利用分光光度法研究了洋金花不同部位提取物對MAO-B的抑制作用。對花提取物抑制數據進行分析， 求得花提取物對MAO-B的半數抑制濃度IC50值。進一步對花提取物抑制MAO-B的動力學進行考察， 根據雙倒數曲線結果判定抑制機制。結果 洋金花提取物對MAO-B有抑制作用， 花部位提取物抑制效果最強， 濃度為1 mg/ml時， 對MAO-B的抑制率為（55.74±1.5）%， 半數抑制濃度IC50為0.75 mg/ml。抑制動力學研究結果表明， 洋金花提取物對MAO-B的抑制作用屬于混合型抑制。結論 洋金花提取物對MAO-B具有明顯抑制作用， 屬于混合性抑制， 這可能是洋金花對PD具治療作用的機制之一。

【關鍵詞】 單胺氧化酶B；抑制；洋金花；帕金森病

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.01.118

【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect and types of Datura metel L. extract on monoamine oxidase B （MAO）-B. Methods Alcohol extraction water sedimentation method was used to obtain fractions from different parts of Datura metel L.， and the yields of the extracts were calculated. Spectrophotometry was used to study the inhibitory effect of different parts of Datura metel L. on MAO-B. The inhibition data of flower extract were analyzed， and the IC50 value of half inhibitory concentration of flower extract to MAO-B was obtained. The kinetics of MAO-B inhibition was further investigated， and the inhibition mechanism was determined according to the results of the double reciprocal curve. Results The extracts of Datura metel L. had the inhibitory effect on MAO-B， and the extracts of flower parts had the strongest inhibitory effect. The inhibitory rate of MAO-B was （55.74±1.5）% at the concentration of 1 mg/ml and the IC50 was 0.75 mg/ml. Inhibition kinetics showed that the inhibitory effect of Datura metel L. on MAO-B was mixed type inhibition. Conclusion Datura metel L. has obvious inhibitory effect on MAO-B， which belongs to the mixed inhibition. It may be one of the mechanisms of Datura metel L. in healing PD.

【Key words】 Monoamine oxidase B； Inhibitory； Datura metel L.； Parkinsons disease

MAO是位于線粒體外膜上的一種黃素蛋白， 包括單胺氧化酶A（MAO-A）和MAO-B兩種亞型， 能催化多種單胺類神經遞質氧化脫氨[1]， 同時釋放過氧化氫， 造成細胞氧化應激。氧化應激是帕金森病（Parkinsons disease， PD）重要發病機制之一[2]， 研究表明， PD發病與MAO活性異常升高密切相關[3]。MAO-B抑制劑在治療PD中具有其獨特優勢， 如長期使用不會產生精神障礙、運動并發癥、異動癥等不良反應[4]。探索和開發新型的MAO-B抑制劑已經成為臨床研究的熱點方向[5]。洋金花（Datura metel L.）又名白花曼陀羅， 為茄科（Solanaceae）曼陀羅屬植物， 主要成分有生物堿類、黃酮類、醉茄內酯類、木質素類、倍半萜類及酚酸類等， 藥用歷史悠久， 具有平喘止咳、解痙鎮痛[6]、抗驚厥[7]、抗氧化[8] 等功效。藥理活性廣泛， 可用于治療銀屑病[9]、類風濕[10]、慢性氣管炎[11]及精神分裂癥[12]等， 也可用于外科麻醉[13]。孫申田等[14]研究表明， 洋金花能有效改善PD患者的臨床癥狀， 對PD具有一定治療作用， 但并未對其治療作用機制進行研究。鑒于此， 本文對洋金花治療PD的機理進行了初步探究， 研究了洋金花提取物對MAO-B的抑制效果， 并對其抑制動力學進行了研究。

1 材料與方法

1. 1 主要儀器及試劑 UV-5200型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）、TGL-20M型臺式高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）、KQ-250DE型醫用數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、RE-3000B型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。鹽酸司來吉蘭購置于SIGMA公司， 其他試劑均為分析純。endprint

1. 2 實驗材料 曼陀羅采于邢臺學院校園北門， 由邢臺學院化學工程與生物技術學院唐偉斌教授鑒定。健康Wistar大鼠， 購于河北省實驗動物中心， 許可證號：SCXK（冀）2003-1-003。

1. 3 方法

1. 3. 1 植物提取物的制備 將植物材料陰干， 粉碎后過

80目篩。用索氏提取法以95%的乙醇、90℃回流提取8 h。濾液減壓蒸發， 加入少量蒸餾水， 超聲震蕩。靜置過夜后將濾液離心， 棄沉淀取上清。將上清液水浴蒸干， 105℃烘干至恒重。置干燥器中冷卻30 min， 迅速精密稱定重量[15]。測定得率。

1. 3. 2 MAO的制備與酶活測定 以Wistar大鼠肝組織為材料提取MAO， 提取方法參考文獻[16]。酶活測定參照文獻[17]。以MAO-B的特異性底物芐胺制備反應體系， 其產物苯甲醛在250 nm處有最大光吸收， 利用分光光度法對MAO-B酶活進行檢測。反應體系為磷酸鉀緩沖液（0.2 M， pH 7.4）， 包含MAO（蛋白濃度為2 mg/ml）， 芐胺。將反應體系于37℃孵育1 h。隨后終止反應， 測定酶活。

1. 3. 3 洋金花提取物對MAO-B的抑制作用 考察洋金花不同部位提取物對MAO-B的抑制作用。反應體系制備同“2.2”， 芐胺濃度固定為其米氏常數Km（0.1 mM[18] ）， 并向其中加入洋金花不同部位提取物（根、莖、葉、花、果實、種子）， 終濃度均為1 mg/ml。以不加入植物提取物的反應體系為對照， 分別測定酶活， 計算抑制率。

1. 3. 4 洋金花花提取物對MAO-B的半數抑制濃度IC50值測定 反應體系制備同“2.2”， 向其中分別加入不同濃度洋金花花提取物（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml）， 考察對MAO-B的抑制作用。分析數據， 計算IC50值。

1. 3. 5 洋金花提取物對MAO-B抑制動力學考察 反應體系制備同“2.2”， 向反應體系中加入不同濃度芐胺（0.1、0.2、0.4 mM）， 考察不同濃度洋金花提取物（0、1 mg/ml）對反應速率的影響。以吸光度值作為反應速率V， 底物芐胺濃度

為[S]， 以1/V對1/[S]作圖， 得到洋金花提取物對MAO-B抑制作用的雙倒數曲線圖， 根據直線相交情況判定抑制作用機制。

2 結果

2. 1 洋金花不同部位提取物對MAO-B的抑制作用 將底物芐胺濃度固定為其米氏常數Km， 考察洋金花不同部位提取物對MAO-B的抑制作用。洋金花花部位提取物對MAO-B的抑制作用最強， 為（55.74±1.5）%， 且提取物得率較高為17.40%；其次為果實、葉、莖、根， 而種子提取物對MAO-B的抑制作用最弱， 僅為（4.37±2.9）%。見表1。孫申田等[14]正是以洋金花花部位研成全粉， 取適量入膠囊對PD患者進行治療。

2. 2 洋金花花提取物對MAO-B的量效抑制關系及IC50值

鑒于花的提取物對MAO-B的抑制作用最強， 因此， 選取花提取物作為抑制劑對MAO-B的量效抑制關系進行考察， 分別選抑制劑取濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml制備反應體系， 以不加抑制劑的體系做對照， 固定各反應體系中芐胺濃度為Km， 求得各濃度抑制劑對MAO-B的抑制率， 并計算其對MAO-B的半數抑制濃度IC50值。見圖1。隨著花提取物濃度的逐漸增加， MAO-B受到的抑制作用也越強。用GraphPad Prism 6對不同濃度下的抑制率數據進行分析， 得到當底物芐胺濃度為其米氏常數Km值時， 洋金花花部位提取物對MAO-B的半數抑制濃度IC50， 司來吉蘭為陽性對照。見表2。

2. 3 洋金花花提取物對MAO-B的抑制機制考察 酶可逆性抑制劑的作用機理主要有4種， 即競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制及混合型抑制。對抑制類型的判斷主要是通過Lineweaver-Burk雙倒數曲線法確定。競爭性抑制作用中， 雙倒數圖中各曲線與x軸交匯于一點；非競爭作用中， 各曲線與y軸交匯于一點；反競爭作用中， 各曲線平行；而混合型抑制作用中， 各曲線交匯于第二或第三象限。從洋金花花提取物對MAO-B抑制作用的雙倒數圖來看， 各曲線于第三象限交匯于一點， 屬于混合型抑制作用。見圖2。

3 小結

本文對洋金花治療PD的機理進行了初步的探究。發現洋金花花提取物對MAO-B抑制效果最強， 抑制機制為混合型抑制， 表明提取物中含有MAO-B的可逆性抑制劑。MAO-B可逆性抑制劑在治療PD中具有其獨特優勢， 如導致不良反應的傾向較小等， 這可能是洋金花治療PD的機制之一。是否具有其他治療作用機制還有待進一步考察。近年來從植物天然產物中尋找MAO-B抑制劑的研究越來越多， 目前已發現的MAO-B抑制劑包括生物堿、香豆素、黃酮、蒽醌類化合物等[19]。洋金花醇提水沉提取物中的有效成分還需進一步研究。

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[收稿日期：2017-10-10]endprint